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Bioquímica

Identificação da quinase Cyclin-dependente 1 sítios de fosforilação específica por uma quinase In Vitro do ensaio

Published: May 03, 2018
doi:
10.3791/57674
, , ,
1Department of Chemistry,State University of New York at Binghamton

Summary

Quinase cyclin-dependente 1 (Cdk1) é ativada na fase G2 do ciclo celular e regula muitos caminhos celulares. Aqui, apresentamos um protocolo para um ensaio da quinase em vitro Cdk1, que permite a identificação dos sítios de fosforilação Cdk1-específicos para o estabelecimento de alvos celulares deste importante quinase.

Abstract

Quinase cyclin-dependente 1 (Cdk1) é um controlador mestre para o ciclo celular em todos os eucariontes e fosforila um estimado 8-13% da proteoma; no entanto, o número de destinos identificados para Cdk1, particularmente em células humanas ainda é baixo. A identificação dos sítios de fosforilação Cdk1 específico é importante, como eles fornecem mecanicistas insights sobre como Cdk1 controla o ciclo celular. Regulação do ciclo celular é essencial para a segregação do cromossomo fiel, e defeitos neste processo complicado levam a aberrações cromossômicas e câncer.

Aqui, descrevemos um em vitro quinase que é usado para identificar locais de fosforilação Cdk1 específicos. Neste ensaio, uma proteína purificada é fosforilada em vitro por comercialmente disponível humana Cdk1/cyclin B. bem sucedido fosforilação é confirmada por SDS-PAGE, e locais de fosforilação são posteriormente identificados por espectrometria de massa. Descrevemos também protocolos de purificação que o rendimento de preparações de proteína altamente puro e homogêneo apropriadas para o ensaio da quinase e um ensaio para a verificação funcional dos sítios identificados fosforilação, que explora a interação entre um sinal de localização nuclear clássica (cNLS) e seu transporte nuclear receptor carioferinas α. Para ajudar com delineamento experimental, revemos abordagens para predição de sítios de fosforilação Cdk1 específicas de sequências de proteínas. Juntos esses protocolos apresentam uma abordagem muito poderosa que produz sites de fosforilação Cdk1 específicos e permite estudos mecanicistas em como Cdk1 controla o ciclo celular. Desde que esse método se baseia em proteínas purified, pode ser aplicado a qualquer modelo organismo e produz resultados confiáveis, especialmente quando combinado com estudos funcionais de célula.

Introduction

As cinases são enzimas que tranferem grupos fosfato do ATP para substratos e regulam muitos processos celulares. Esta fosforilação é reversível, rápido, adiciona duas cargas negativas e armazena energia livre e é uma das modificações posttranslational mais comuns usadas pelas células. Cdk1, que é também conhecido como o homólogo de proteína 2 de ciclo de divisão celular (cdc2) é um controlador mestre do ciclo celular em todos os eucariontes1,2,3,4,5e fosforila um Estima-se 8-13% do proteome6,7.

Enquanto estudos recentes de proteomic identificaram muitos sítios de fosforilação de proteínas, na maioria dos casos, a quinase responsável por essas modificações é desconhecida. O número de conhecidos destinos Cdk1, particularmente em células humanas é baixo7. A identificação dos sítios de fosforilação Cdk1 específico é importante, como permite estudos mecanicistas que estabelecem como Cdk1 controla o ciclo celular. Regulação do ciclo celular é importante para a segregação do cromossomo fiel e divisão celular, e uma miríade de processos celulares precisam ocorrer para apoiar esta importante função fisiológica. Isso inclui travar a transcrição e tradução antes do início da mitose, bem como uma reorganização dramática na estrutura celular e organização, tais como a desmontagem do envoltório nuclear, condensação do cromossomo e montagem do fuso mitótico. Desregulamentação e erros nestes processos causam câncer, defeitos de nascimento ou morte celular mitótica. Inibidores específicos de Cdk1 como RO-3306 foram desenvolvidos8, que fornece ferramentas poderosas para estudos funcionais, e alguns destes inibidores são atualmente em ensaios clínicos para tratamento de câncer (veja9 para revisão).

Aqui, descrevemos um em vitro quinase que permite a identificação dos sítios de fosforilação Cdk1 específicos. Neste ensaio, comercialmente disponível humana Cdk1/cyclin B é usado para fosforilar um alvo purificado da proteína em vitro. Fosforilação do substrato aumenta a sua massa e adiciona duas cargas negativas; Portanto, fosforilação sucesso é confirmada por um deslocamento para cima da banda gel de proteína em SDS-PAGE. Sites específicos de Cdk1 fosforilação são posteriormente identificados por análise de espectrometria de massa da proteína em vitro fosforilada. Para ajudar com delineamento experimental, revisamos também ferramentas computacionais e referências para a previsão dos sítios de fosforilação Cdk1 específica da sequência de proteínas. Além disso, podemos também descrever protocolos de purificação que o rendimento de preparações de proteína altamente puro e homogêneo apropriadas para o ensaio da quinase. Finalmente, os sítios de fosforilação identificado devem ser verificados por estudos funcionais, e um ensaio simples é descrito aqui para essa finalidade. Combinada, esta é uma abordagem muito poderosa que produz sites de fosforilação Cdk1 específicos e permite estudos mecanicistas em como Cdk1 controla o ciclo celular7,10,11. Desde que esse método se baseia em proteínas purified, pode ser aplicado a quaisquer resultados fiáveis modelo organismo e rendimentos. No entanto, é recomendada verificação funcional da fosforilação obtidos sites em vitro , como as células têm mecanismos reguladores adicionais no lugar, como modificações posttranslational, parceiros de interação ou localização celular que pode processar sites fosforilação acessível ou inacessível para reconhecimento por Cdk1.

Cdk1 reconhece um site de fosforilação de consenso que consiste em arquivos em (Ser/Thr-Pro-X-Lys/Arg), onde X é qualquer resíduo e uma serina ou treonina é o sítio de fosforilação. Especialmente importante para o reconhecimento é a presença da prolina na posição + 1. Além disso, os resíduos básicos são preferidos nas posições + 2 ou + 3, com a maioria dos sites de fosforilação Cdk1 específicas contendo um Lys ou Arg + a 3 posição6,12.

Ativação de Cdk1 é fortemente regulamentada e leva ao aparecimento de mitose1,2,3,4,5. A atividade de quinases cyclin-dependente em geral depende de sua associação com ciclinas distintas (ciclina A, B, C, D e E em seres humanos), que são expressos em níveis durante todo o ciclo celular13de oscilação. Expressão de Cdk1 é constante em todo o ciclo celular e a regulação da sua actividade baseia-se na sua associação com as subunidades reguladoras cyclin A e cyclin B5,13,14,15, como bem como modificações borne-translational. Formação do complexo Cdk1/cyclin B é necessária para a quinase ativação5,14,15,16,17,18. Na fase G2, ciclina B é traduzido no citoplasma e importada para o núcleo onde se liga ao Cdk15,14,15,16,17,18; no entanto, B Cdk1/cyclin realiza inativada por fosforilação em resíduos Thr14 e Tyr15 pelos humano Cdk1-inibitório quinases Myt1 (quinase cdc2-inibitório de membrana-associado tirosina e treonina-específico) e Wee1, respectivamente,19, 20,21. Na fase tardia do G2, desfosforilação de Thr14 e Tyr15 por divisão celular ciclo 25 fosfatase (cdc25) ativa a atividade da quinase do complexo Cdk1/cyclin B e desencadeia o início da mitose12,14, 18 , 20 , 22 , 23. a fosforilação de Thr161 também é necessária para ativação de Cdk1/cyclin B e é mediada por Cdk7, o Cdk-activação da quinase (CAK)18. Degradação da ciclina B em anáfase inactivates Cdk1, permitindo a saída de mitose24,25. Ativação de Cdk1/cyclin B, portanto, é um processo complicado. O protocolo aqui apresentado é realizado com b de Cdk1/cyclin comercialmente disponível. Durante a expressão recombinante deste complexo em células de inseto, é ativado na vivo por quinases endógena14,20 e permanece ativa no estado purificado. Resultante ativo, recombinante humana Cdk1/cyclin B é apropriado para ensaios de quinase em vitro .

Aqui, descrevemos um protocolo para a identificação dos sítios de fosforilação Cdk1 específicas do centrômero humano proteína F (CENP-F)10. CENP-F é uma proteína de cinetócoro que reside no núcleo durante a interfase (G1 e S-fase) e é exportada para o citosol no G2 fase26,,27,28 em uma maneira dependente Cdk110, 11. localização nuclear é conferida por um bipartido cNLS26. cNLSs são reconhecidos pelo transporte nuclear factor carioferinas α, que facilita, em conjunto com carioferinas β e RanGDP, a importação de cNLS-carga para o núcleo de29. A exportação nuclear na fase G2 é facilitada através de uma exportação desconhecido caminho10. Uma vez que o CENP-F reside no citosol, ele é recrutado para o envelope nuclear e recrutas por sua vez o motor proteína Dineína complexo30,31. Esta via é importante posicionar o núcleo respectivo para a centrossoma durante os estágios iniciais da montagem do fuso mitótico de forma dependente de Dineína, que é importante para o timing correto de entrada mitótica e para um processo fundamental no cérebro desenvolvimento de31,30,32. Começando na fase G2, CENP-F é também montado no cinetócoro onde tem papéis importantes para cromossomo fiel segregação27,28,33,34,35 . Um passo chave reguladora destas vias é a exportação nuclear do CENP-F na fase G2, que é dependente de Cdk110,11. Descrevemos aqui um protocolo para a identificação dos sítios de fosforilação Cdk1 específicos no cNLS do CENP-F. Phosphomimetic mutações desses sites devagar importação nuclear do CENP-F, sugerindo que B Cdk1/cyclin diretamente regula a localização celular do CENP-F por fosforilação de sua cNLS10.

Em geral, este ensaio da quinase em vitro permite a identificação de substratos específicos para proteínas quinase Cdk1. Purified alvo são fosforilada em vitro pelo complexo B Cdk1/cyclin comercialmente disponível e os locais de fosforilação posteriormente são identificados por espectrometria de massa. A identificação dos sítios de fosforilação específica Cdk1 suporta mecanicistas estudos que revelam como a Cdk1 controla o ciclo celular.

Protocol

1. Previsão de Sites específicos Cdk1 fosforilação da sequência de proteína Antes de começar o ensaio da quinase, analisar a sequência da proteína para sites de fosforilação previstas Cdk1 específicos e pesquisar a literatura para sítios de fosforilação experimentalmente estabelecido com especificidade quinase desconhecido. Use as seguintes ferramentas, bancos de dados e referências que são resumidas. Use o iGPS 3.0 software36,37</sup…

Representative Results

Recentemente nós usamos um em vitro quinase (Figura 1) para identificar locais de fosforilação Cdk1 específicos em um fragmento do CENP-F que continha um cNLS10. Este sinal confira localização nuclear do CENP-F durante a maior parte da interfase. Na fase G2, CENP-F é exportado do núcleo para o citosol na forma Cdk1-dependente. Para obter insights mecanicistas sobre como Cdk1 regula a localização celular do CENP-F, an…

Discussion

Nosso ensaio da quinase em vitro é um método muito poderoso para identificar alvos moleculares para a quinase Cdk1, que é um controlador mestre do ciclo celular e regula muitos processos celulares importantes. O método determina se uma proteína purificada é um substrato para a Cdk1 e permite a identificação dos sítios de fosforilação específica. Isto facilita estudos mecanicistas para regulação de processos celulares por fosforilação através de Cdk1.

O fator mais crí…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Agradecemos o Dr. David King, Howard Hughes Medical Institute, Universidade da Califórnia em Berkeley por análise de espectrometria de massa e comentários úteis. Agradecemos o Dr. Xuelian Zhu, Shanghai, institutos de ciências biológicas, da Academia Chinesa de Ciências, Shanghai, China para fornecer uma construção completo do CENP-F. Finalmente, agradecemos a Dr. Susan Bane, Dr. Brian Callahan e Dr. Christof Grewer na Binghamton University para acesso ao equipamento. Esta pesquisa foi financiada pela Fundação de pesquisa para a Universidade Estadual de Nova York e o departamento de química, Universidade Estadual de Nova York em Binghamton.

Materials

2800 ml baffled Fernbach flask Corning 44232XL
ampicillin Gold Biotechnology A-301-25
ATP Fisher Scientfiic BP413-25
benzamidine hydrochloride Millipore Sigma B6506-25
bottletop filter Corning 431161
Cdk1/cyclin B recombinant, human 20,000 U/mL New England Biolabs P6020
Cdk1/cyclin B (alternate source) EMD Millipore 14-450
Cdk1/cyclin B (alternate source) Invitrogen PV3292
Cdk1/cyclin B + 10x PK buffer New England Biolabs P6020
CENP-F (residues 2987 – 3065) pGEX6P1 plasmid Available upon request.
centrifuge: Heraeus Multifuge X3R, cooled, with TX-1000 swing-out rotor Thermo Scientific 10033-778
centrifugal filter units: Amicon Ultra-15 centrifugal filter units, 3 kDa cutoff, Ultracel-PL membranes EMD Millipore UFC900324
chlorampenicol Gold Biotechnology C-105-100
D/L methionine Agros Organics / Fisher 125650010
desalting pipet tips: Zip tips Millipore Sigma ZTC18S008
disposable chromatography columns, Econo-Pac 1.5 x 12 cm Biorad 7321010
dithiothreitol Gold Biotechnology DTT50
E. coli Rosetta 2(DE3)pLysS strain EMD Millipore 71403
electrospray ionization Fourier transform ion Bruker Amazon Apex III
cyclotron resonance mass spectrometer
electrospray ionization ion trap mass spectrometer Bruker Amazon custom
fixed angle rotor: Fiberlite F15-8x-50cy Thermo Scientific 97040-276
FPLC system: Äkta Pure FPLC GE Healthcare 29032697
Gel filtration column: Superdex 200 Increase 10/300 GL GE Healthcare 28990944
glutathione agarose Pierce 16101
glutathione, reduced Millipore Sigma G4251-50g
incubation shaker: multitron shaker Infors I10102
isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside Gold Biotechnology I2481C50
kanamycin Gold Biotechnology K-120-25
karyopherin α pet-28a pres plasmid Available upon request.
Luria Bertani medium Fisher Scientfiic BP1426-2
microcentrifuge 5418R, refrigerated Eppendorf 5401000013
microtubes (0.5 ml) Eppendorf 30121023
microtubes (1.5 ml) Eppendorf 30120086
Nickel affinity gel: His-Select Nickel affinity gel Millipore Sigma P6611-100ml
pGEX-6P-1 plasmid Millipore Sigma GE28-9546-48
phenylmethylsulfonyl fluoride Gold Biotechnology P470-10
PS protease: PreScission protease GE Healthcare 27084301
Phos-tag acrylamide Wako Pure Chem. Ind. 304-93521
reduced gluthathione Millipore Sigma G4251-50g
roundbottom centrifuge tubes (Oakridge tubes) Fisher Scientfiic 055291D
site-directed mutagenesis kit: QuikChange Lightning Agilent 210518
Site-Directed Mutagenesis Kit
sonifier: Branson S-250D sonifier Branson 15 338 125
Spectra/Por 1RC dialysis membrane (6-8 kDa cutoff) Spectrum Labs 08 670B
swing out rotor TX-1000 Thermo Scientific 10033-778
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Cui, H., Loftus, K. M., Noell, C. R., Solmaz, S. R. Identification of Cyclin-dependent Kinase 1 Specific Phosphorylation Sites by an In Vitro Kinase Assay. J. Vis. Exp. (135), e57674, doi:10.3791/57674 (2018).
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