Identifiering av cyklin-beroende Kinase 1 särskilda fosforylering platser av ett In Vitro -Kinas Assay
Summary
Cyklin-beroende kinase 1 (Cdk1) aktiveras i den G2-fasen i cellcykeln och reglerar många cellulära vägar. Här presenterar vi ett protokoll för en in vitro- Kinas analys med Cdk1, som möjliggör identifiering av Cdk1-specifika fosforylering platser för fastställande av cellulära mål denna viktigt-Kinas.
Abstract
Cyklin-beroende kinase 1 (Cdk1) är en master controller för cellcykeln i alla eukaryota organismer och phosphorylates uppskattningsvis 8-13% av proteomet; antalet fastställda mål för Cdk1, särskilt i mänskliga celler är dock fortfarande låg. Identifiering av Cdk1-specifika fosforylering platser är viktigt, eftersom de ger mekanistiska insikter i hur Cdk1 styr cellcykeln. Cellcykelns reglering är kritiska för trogna kromosomsegregering och defekter i denna komplicerade process leda till kromosomavvikelser och cancer.
Här beskriver vi en in vitro- Kinas analysmetod som används för att identifiera Cdk1-specifika fosforylering platser. I denna analys, är ett renat protein fosforyleras i vitro av kommersiellt tillgängliga mänskliga Cdk1/cyklin B. framgångsrika fosforylering bekräftas av SDS-PAGE, och fosforylering platser identifieras därefter med masspektrometri. Vi beskriver också rening protokoll som ger mycket ren och homogen protein preparat passar kinase analysen, och en bindande analys för funktionell kontroll av de identifiera fosforylering webbplatser, som sonder samspelet mellan en klassisk cellkärnelokalisering signal (cNLS) och dess nukleära transporter receptor karyopherin α. För att underlätta med experimentell design, granskar vi metoder för förutsägelse av Cdk1-specifika fosforylering platser från proteinsekvenser. Tillsammans ger dessa protokoll en mycket kraftfull metod som ger Cdk1-specifika fosforylering platser och möjliggör mekanistiska studier i hur Cdk1 styr cellcykeln. Eftersom denna metod förlitar sig på renade proteiner, kan det tillämpas på modellen organism och avkastning tillförlitliga resultat, särskilt i kombination med cell funktionella studier.
Introduction
Kinaser är enzymer som transfererar fosfat från ATP på substrat och reglerar många cellulära processer. Detta fosforylering är reversibel, snabb, lägger två negativa laddningar, och lagrar fri energi och är en av de vanligaste posttranslationell ändringar används av celler. Cdk1, som också kallas cell division cycle protein 2 homolog (cdc2) är en master controller för cellcykeln i alla eukaryota organismer1,2,3,4,5, och phosphorylates en uppskattningsvis 8-13% av proteomet6,7.
Medan nyare proteomiska studier har identifierat många fosforylering platser i proteiner, i de flesta fall, är tyrosinkinashämmare som är ansvarig för dessa ändringar okänd. Antalet kända Cdk1 mål, särskilt i mänskliga celler är låg7. Identifiering av Cdk1-specifika fosforylering platser är viktigt, eftersom det möjliggör mekanistiska studier som fastställer hur Cdk1 styr cellcykeln. Cellcykelns reglering är viktigt för trogna kromosomsegregering och celldelningen, och en myriad av cellulära processer måste ske för att stödja denna viktiga fysiologiska funktion. Detta inkluderar att stoppa transkription och translation före uppkomsten av Mitos, liksom en dramatisk omorganisation i cellstruktur och organisation, till exempel demontering av kärn kuvert, kromosom kondens och mitotiska spindelenhet. Avreglering och fel i dessa processer orsaka cancer, fosterskador eller mitotiska celldöd. Hämmare av Cdk1 såsom RO-3306 var utvecklade8, som ger kraftfulla verktyg för funktionella studier, och några av dessa hämmare är för närvarande i kliniska prövningar för behandling av cancer (se9 för granskning).
Här beskriver vi en in vitro- Kinas analysmetod som möjliggör identifiering av Cdk1-specifika fosforylering platser. I denna analys används kommersiellt tillgängliga mänskliga Cdk1/cyklin B att fosforylera en renad mål protein i vitro. Fosforylering av substrat ökar dess massa och lägger till två negativa laddningar; Därför bekräftas framgångsrika fosforylering av en uppåtvinkling protein gel bandet på SDS-PAGE. Cdk1-specifika fosforylering platser identifieras senare av masspektrometri analys av proteinet i vitro fosforyleras. För att underlätta med experimentell design, granskar vi även beräkningsverktyg och referenser för förutsägelse av Cdk1-specifika fosforylering platser från proteinsekvens. Dessutom beskriver vi också rening protokoll som ger mycket ren och homogen protein preparat lämplig för Kinas analysen. Slutligen de identifiera fosforylering webbplatserna måste kontrolleras av funktionella studier, och en enkel bindning analys beskrivs här för ändamålet. Kombinerat, är detta en mycket kraftfull metod som ger Cdk1-specifika fosforylering platser och möjliggör mekanistiska studier i hur Cdk1 styr cellcykeln7,10,11. Eftersom denna metod förlitar sig på renade proteiner, kan det tillämpas på någon modell organismen och ger tillförlitliga resultat. Men funktionell kontroll av den erhållna fosforylering platser i vitro rekommenderas, eftersom cellerna har ytterligare reglerande mekanismer på plats, såsom posttranslationell modifieringar, interaktion partner eller cellulär lokalisering som kan göra fosforylering platser tillgängliga eller otillgängliga för erkännande av Cdk1.
Cdk1 erkänner en konsensus fosforylering webbplats som består av (Ser/Thr-Pro-X-Lys/Arg), där X är alla rester och en serin eller treonin är platsen för fosforylering. Särskilt viktigt för erkännande är förekomsten av prolin i + 1 position. Dessutom grundläggande rester är att föredra i + 2 eller + 3 positioner, med de flesta Cdk1-specifika fosforylering webbplatser som innehåller en Lys eller Arg på de + 3 position6,12.
Aktivering av Cdk1 är hårt reglerad och leder till uppkomsten av Mitos1,2,3,4,5. Aktiviteten av cyklin-beroende kinaser beror i allmänhet på deras förening med distinkta cyclins (cyklin A, B, C, D, och E hos människor), som uttrycks på svängande nivåer i hela cellcykeln13. Cdk1 uttryck är konstant över cellcykeln och regleringen av dess aktivitet är beroende av dess förening med föreskrivande subunitsna cyklin A och cyklin B5,13,14,15, som samt post-translationella modifieringar. Bildandet av Cdk1/cyklin B-komplex krävs för Kinas aktivering5,14,15,16,17,18. I den G2-fasen, är cyklin B översatt i cytosolen och importeras in i cellkärnan där det binder till Cdk15,14,15,16,17,18. dock hålls Cdk1/cyklin B inaktiverade genom fosforylering på rester Thr14 och Tyr15 av de mänskliga Cdk1-hämmande kinaser Myt1 (membran-associerade tyrosin – och treonin-specifika cdc2-hämmande kinase) och Wee1, respektive19, 20,21. I den sena G2-fasen, Defosforylering av Thr14 och Tyr15 av celldelning cykel 25 fosfatas (cdc25) aktiverar kinase aktiviteten av Cdk1/cyklin B-komplex och utlöser inledandet av Mitos12,14, 18 , 20 , 22 , 23. fosforylering av Thr161 krävs också för Cdk1/cyklin B aktivering och medieras av Cdk7, Cdk-aktiverande kinase (CAK)18. Nedbrytning av cyklin B i Anaphasen inactivates Cdk1, så att utloppet från Mitos24,25. Aktivering av Cdk1/cyklin B är därför en komplicerad process. Det protokoll som presenteras här utförs med kommersiellt tillgängliga Cdk1/cyklin B. Under rekombinant uttryck för detta komplex i insekt celler, det är aktiverat i vivo av endogena kinaser14,20 och förblir aktiv i tillståndet renat. Den resulterande aktiv, rekombinant humant Cdk1/cyklin B är lämplig för in vitro- Kinas analyser.
Här beskriver vi ett protokoll för identifiering av Cdk1-specifika fosforylering platser i mänskliga centromer protein F (CENP-F)10. CENP-F är en Kinetochor protein som finns i kärnan under större delen av interphase (G1 och S-fas) och exporteras till cytosolen i G2 fas26,27,28 Cdk1-beroende sätt10, 11. cellkärnelokalisering ges av en bipartit cNLS26. cNLSs känns igen av den nukleära transporter faktor karyopherin α, vilket underlättar, tillsammans med karyopherin β och RanGDP, import av cNLS-Last till nucleus29. Kärnteknisk export i fasen G2 underlättas via en okänd export väg10. När CENP-F finns i cytosolen, det rekryteras att kärn kuvertet och i sin tur rekryterar de motoriska protein komplexa dynein30,31. Denna väg är viktigt att placera kärnan respektive till centrosome under inledningsskedet av mitotiska spindelenhet i ett dynein dosberoende sätt, vilket är viktigt för den rätta tidpunkten för mitotiska inträde och för en grundläggande process i hjärnan utveckling30,31,32. Start i den G2-fasen, monteras CENP-F också i Kinetochor där det har viktiga roller för trogna kromosom segregation27,28,33,34,35 . En viktig reglerande steg av dessa vägar är kärnteknisk export av CENP-F i den G2-fasen, som är beroende av Cdk110,11. Vi beskriver här ett protokoll för identifiering av Cdk1-specifika fosforylering platser i cNLS CENP-f. Phosphomimetic mutationer i dessa platser sakta ner nukleära import av CENP-F, vilket tyder på att Cdk1/cyklin B direkt reglerar cellulär lokalisering av CENP-F genom fosforylering av dess cNLS10.
Sammantaget möjliggör denna in vitro- Kinas analys identifiering av specifika substrat för Kinas Cdk1. renat mål proteinerna är fosforylerade in vitro- av kommersiellt tillgängliga Cdk1/cyklin B-komplex och fosforylering webbplatser är därefter identifierade genom masspektrometri. Identifiering av Cdk1-specifika fosforylering platser stöder mekanistiska studier som avslöjar hur Cdk1 styr cellcykeln.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vår i vitro kinase analysen är en mycket kraftfull metod att identifiera molekylära mål för Kinas Cdk1, som är en master controller av cellcykeln och reglerar många viktiga cellulära processer. Metoden avgör om ett renat protein är ett substrat för Cdk1 och tillåter identifiering av specifika fosforylering platser. Detta underlättar mekanistiska studier för reglering av cellulära processer genom fosforylering via Cdk1.
Den mest kritiska faktorn för framgångsrik identi…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi tackar Dr. David King, Howard Hughes Medical Institute, University of California i Berkeley för masspektrometri analys och hjälpsamma kommentarer. Vi tackar Dr. Xuelian Zhu, Shanghai, institut för biologiska vetenskaper, kinesiska vetenskapsakademin, Shanghai, Kina för att tillhandahålla en fullängds CENP-F-konstruktion. Slutligen, vi tackar Dr. Susan Bane, Dr Brian Callahan och Dr Christof Grewer vid Binghamton University för tillgång till utrustning. Forskningen finansierades av stiftelsen forskning för State University of New York och Institutionen för kemi, State University of New York vid Binghamton.
Materials
| 2800 ml baffled Fernbach flask | Corning | 44232XL | |
| ampicillin | Gold Biotechnology | A-301-25 | |
| ATP | Fisher Scientfiic | BP413-25 | |
| benzamidine hydrochloride | Millipore Sigma | B6506-25 | |
| bottletop filter | Corning | 431161 | |
| Cdk1/cyclin B recombinant, human 20,000 U/mL | New England Biolabs | P6020 | |
| Cdk1/cyclin B (alternate source) | EMD Millipore | 14-450 | |
| Cdk1/cyclin B (alternate source) | Invitrogen | PV3292 | |
| Cdk1/cyclin B + 10x PK buffer | New England Biolabs | P6020 | |
| CENP-F (residues 2987 – 3065) pGEX6P1 plasmid | Available upon request. | ||
| centrifuge: Heraeus Multifuge X3R, cooled, with TX-1000 swing-out rotor | Thermo Scientific | 10033-778 | |
| centrifugal filter units: Amicon Ultra-15 centrifugal filter units, 3 kDa cutoff, Ultracel-PL membranes | EMD Millipore | UFC900324 | |
| chlorampenicol | Gold Biotechnology | C-105-100 | |
| D/L methionine | Agros Organics / Fisher | 125650010 | |
| desalting pipet tips: Zip tips | Millipore Sigma | ZTC18S008 | |
| disposable chromatography columns, Econo-Pac 1.5 x 12 cm | Biorad | 7321010 | |
| dithiothreitol | Gold Biotechnology | DTT50 | |
| E. coli Rosetta 2(DE3)pLysS strain | EMD Millipore | 71403 | |
| electrospray ionization Fourier transform ion | Bruker Amazon | Apex III | |
| cyclotron resonance mass spectrometer | |||
| electrospray ionization ion trap mass spectrometer | Bruker Amazon | custom | |
| fixed angle rotor: Fiberlite F15-8x-50cy | Thermo Scientific | 97040-276 | |
| FPLC system: Äkta Pure FPLC | GE Healthcare | 29032697 | |
| Gel filtration column: Superdex 200 Increase 10/300 GL | GE Healthcare | 28990944 | |
| glutathione agarose | Pierce | 16101 | |
| glutathione, reduced | Millipore Sigma | G4251-50g | |
| incubation shaker: multitron shaker | Infors | I10102 | |
| isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside | Gold Biotechnology | I2481C50 | |
| kanamycin | Gold Biotechnology | K-120-25 | |
| karyopherin α pet-28a pres plasmid | Available upon request. | ||
| Luria Bertani medium | Fisher Scientfiic | BP1426-2 | |
| microcentrifuge 5418R, refrigerated | Eppendorf | 5401000013 | |
| microtubes (0.5 ml) | Eppendorf | 30121023 | |
| microtubes (1.5 ml) | Eppendorf | 30120086 | |
| Nickel affinity gel: His-Select Nickel affinity gel | Millipore Sigma | P6611-100ml | |
| pGEX-6P-1 plasmid | Millipore Sigma | GE28-9546-48 | |
| phenylmethylsulfonyl fluoride | Gold Biotechnology | P470-10 | |
| PS protease: PreScission protease | GE Healthcare | 27084301 | |
| Phos-tag acrylamide | Wako Pure Chem. Ind. | 304-93521 | |
| reduced gluthathione | Millipore Sigma | G4251-50g | |
| roundbottom centrifuge tubes (Oakridge tubes) | Fisher Scientfiic | 055291D | |
| site-directed mutagenesis kit: QuikChange Lightning | Agilent | 210518 | |
| Site-Directed Mutagenesis Kit | |||
| sonifier: Branson S-250D sonifier | Branson | 15 338 125 | |
| Spectra/Por 1RC dialysis membrane (6-8 kDa cutoff) | Spectrum Labs | 08 670B | |
| swing out rotor TX-1000 | Thermo Scientific | 10033-778 |
References
- Nurse, P. Cyclin dependent kinases and cell cycle control (Nobel Lecture). ChemBioChem. 3 (7), 596-603 (2002).
- Lee, M. G., Nurse, P. Complementation used to clone a human homologue of the fission yeast cell cycle control gene cdc2. Nature. 327, 31 (1987).
- Lohka, M. J., Hayes, M. K., Maller, J. L. Purification of maturation-promoting factor, an intracellular regulator of early mitotic events. Proc Natl Acad of Sci U S A. 85 (9), 3009-3013 (1988).
- Gautier, J., Norbury, C., Lohka, M., Nurse, P., Maller, J. Purified maturation-promoting factor contains the product of a Xenopus homolog of the fission yeast cell cycle control gene. Cell. 54 (3), 433-439 (1988).
- Gautier, J., Minshull, J., Lohka, M., Glotzer, M., Hunt, T., Maller, J. L. Cyclin is a component of maturation-promoting factor from Xenopus. Cell. 60 (3), 487-494 (1990).
- Ubersax, J. A., Woodbury, E. L., Quang, P. N., Paraz, M., Blethrow, J. D., Shah, K., Shokat, K. M., Morgan, D. O. Targets of the cyclin-dependent kinase Cdk1. Nature. 425 (6960), 859-864 (2003).
- Petrone, A., Adamo, M. E., Cheng, C., Kettenbach, A. N. Identification of Candidate Cyclin-dependent kinase 1 (Cdk1) Substrates in Mitosis by Quantitative Phosphoproteomics. Mol Cell Proteomics. 15 (7), 2448-2461 (2016).
- Vassilev, L. T., Tovar, C., Chen, S., Knezevic, D., Zhao, X., Sun, H., Heimbrook, D. C., Chen, L. Selective small-molecule inhibitor reveals critical mitotic functions of human CDK1. Proc Natl Acad of Sci U S A. 103 (28), 10660-10665 (2006).
- Balakrishnan, A., Vyas, A., Deshpande, K., Vyas, D. Pharmacological cyclin dependent kinase inhibitors: Implications for colorectal cancer. World J Gastroenterol. 22 (7), 2159-2164 (2016).
- Loftus, K. M., Coutavas, E., Cui, H., King, D., Ceravolo, A., Pereiras, D., Solmaz, S. Mechanism for G2 phase-specific nuclear export of the kinetochore protein CENP-F. Cell Cycle. 16 (15), 1414-1429 (2017).
- Baffet, A. D., Hu, D. J., Vallee, R. B. Cdk1 activates pre-mitotic nuclear envelope dynein recruitment and apical nuclear migration in neural stem cells. Dev Cell. 33 (6), 703-716 (2015).
- Songyang, Z., Blechner, S., Hoagland, N., Hoekstra, M. F., Piwnica-Worms, H., Cantley, L. C. Use of an oriented peptide library to determine the optimal substrates of protein kinases. Curr Biol. 4 (11), 973-982 (1994).
- Malumbres, M. Cyclin-dependent kinases. Genome Biol. 15 (6), 122 (2014).
- Peeper, D. S., Parker, L. L., Ewen, M. E., Toebes, M., Hall, F. L., Xu, M., Zantema, A., van der Eb, A. J., Piwnica-Worms, H. A- and B-type cyclins differentially modulate substrate specificity of cyclin-cdk complexes. EMBO J. 12 (5), 1947-1954 (1993).
- Trembley, J., Ebbert, J., Kren, B., Steer, C. Differential regulation of cyclin B1 RNA and protein expression during hepatocyte growth in vivo. Cell Growth Differ. 7 (7), 903-916 (1996).
- Pines, J., Hunter, T. The differential localization of human cyclins A and B is due to a cytoplasmic retention signal in cyclin B. EMBO J. 13 (16), 3772-3781 (1994).
- Morgan, D. O. Principles of CDK regulation. Nature. 374, 131 (1995).
- Larochelle, S., Merrick, K. A., Terret, M. -. E., Wohlbold, L., Barboza, N. M., Zhang, C., Shokat, K. M., Jallepalli, P. V., Fisher, R. P. Requirements for Cdk7 in the assembly of Cdk1/cyclin B and activation of Cdk2 revealed by chemical genetics in human cells. Mol cell. 25 (6), 839-850 (2007).
- Parker, L. L., Sylvestre, P. J., Byrnes, M. J., Liu, F., Piwnica-Worms, H. Identification of a 95-kDa WEE1-like tyrosine kinase in HeLa cells. Proc Natl Acad of Sci U S A. 92 (21), 9638-9642 (1995).
- Atherton-Fessler, S., Parker, L. L., Geahlen, R. L., Piwnica-Worms, H. Mechanisms of p34cdc2 regulation. Mol Cell Biol. 13 (3), 1675-1685 (1993).
- Liu, F., Stanton, J. J., Wu, Z., Piwnica-Worms, H. The human Myt1 kinase preferentially phosphorylates Cdc2 on threonine 14 and localizes to the endoplasmic reticulum and Golgi complex. Mol Cell Biol. 17 (2), 571-583 (1997).
- McGowan, C. H., Russell, P. Human Wee1 kinase inhibits cell division by phosphorylating p34cdc2 exclusively on Tyr15. EMBO J. 12 (1), 75-85 (1993).
- Strausfeld, U., Labbé, J. C., Fesquet, D., Cavadore, J. C., Picard, A., Sadhu, K., Russell, P., Dorée, M. Dephosphorylation and activation of a p34cdc2/cyclin B complex in vitro by human CDC25 protein. Nature. 351, 242 (1991).
- Leuken, R., Clijsters, L., Wolthuis, R. To cell cycle, swing the APC/C. Biochim Biophys Acta. 1786 (1), 49-59 (2008).
- Acquaviva, C., Pines, J. The anaphase-promoting complex/cyclosome: APC/C. J Cell Sci. 119 (12), 2401-2404 (2006).
- Zhu, X., Chang, K. -. H., He, D., Mancini, M. A., Brinkley, W. R., Lee, W. -. H. The C-terminus of mitosin is essential for its nuclear localization, centromere/kinetochore targeting, and dimerization. J Biol Chem. 270 (33), 19545-19550 (1995).
- Liao, H., Winkfein, R. J., Mack, G., Rattner, J. B., Yen, T. J. CENP-F is a protein of the nuclear matrix that assembles onto kinetochores at late G2 and is rapidly degraded after mitosis. J Cell Biol. 130 (3), 507-518 (1995).
- Rattner, J. B., Rao, A., Fritzler, M. J., Valencia, D. W., Yen, T. J. CENP-F is a ca 400 kDa kinetochore protein that exhibits a cell-cycle dependent localization. Cell Motil Cytoskeleton. 26 (3), 214-226 (1993).
- Christie, M., Chang, C. -. W., Rona, G., Smith, K. M., Stewart, A. G., Takeda, A. A. S., Fontes, M. R. M., Stewart, M., Vertessy, B. G., Forwood, J. K., Kobe, B. Structural biology and regulation of protein import into the nucleus. J Mol Biol. 428 (10A), 2060-2090 (2016).
- Zuccolo, M., Alves, A., Galy, V., Bolhy, S., Formstecher, E., Racine, V., Sibarita, J. B., Fukagawa, T., Shiekhattar, R., Yen, T., Doye, V. The human Nup107/160 nuclear pore subcomplex contributes to proper kinetochore functions. EMBO J. 26, 1853-1864 (2007).
- Bolhy, S., Bouhlel, I., Dultz, E., Nayak, T., Zuccolo, M., Gatti, X., Vallee, R., Ellenberg, J., Doye, V. A Nup133-dependent NPC-anchored network tethers centrosomes to the nuclear envelope in prophase. J Cell Biol. 192 (5), 855-871 (2011).
- Hu, D. J., Baffet, A. D., Nayak, T., Akhmanova, A., Doye, V., Vallee, R. B. Dynein recruitment to nuclear pores activates apical nuclear migration and mitotic entry in brain progenitor cells. Cell. 154 (6), 1300-1313 (2013).
- Vergnolle, M. S., Taylor, S. S. Cenp-F links kinetochores to Ndel1/Nde1/Lis1/Dynein microtubule motor complexes. Curr Biol. 17 (13), 1173-1179 (2007).
- Yang, Z. Y., Guo, J., Li, N., Qian, M., Wang, S. N., Zhu, X. L. Mitosin/CENP-F is a conserved kinetochore protein subjected to cytoplasmic dynein-mediated poleward transport. Cell Res. 13 (4), 275-283 (2003).
- Yang, Z., Guo, J., Chen, Q., Ding, C., Du, J., Zhu, X. Silencing mitosin induces misaligned chromosomes, premature chromosome decondensation before anaphase onset, and mitotic cell death. Mol Cell Biol. 25 (10), 4062-4074 (2005).
- Xue, Y., Ren, J., Gao, X., Jin, C., Wen, L., Yao, X. GPS 2.0, a tool to predict kinase-specific phosphorylation sites in hierarchy. Mol Cell Proteomics. 7 (9), 1598-1608 (2008).
- Song, C., Ye, M., Liu, Z., Cheng, H., Jiang, X., Han, G., Songyang, Z., Tan, Y., Wang, H., Ren, J., Xue, Y., Zou, H. Systematic analysis of protein phosphorylation networks from phosphoproteomic data. Mol Cell Proteomics. 11 (10), 1070-1083 (2012).
- UniProt-Consortium. UniProt: the universal protein knowledgebase. Nucleic Acids Res. 45 (D1), D158-D169 (2017).
- Olsen, J. V., Vermeulen, M., Santamaria, A., Kumar, C., Miller, M. L., Jensen, L. J., Gnad, F., Cox, J., Jensen, T. S., Nigg, E. A., Brunak, S., Mann, M. Quantitative phosphoproteomics reveals widespread full phosphorylation site occupancy during mitosis. Science Signal. 3 (104), ra3 (2010).
- Dephoure, N., Zhou, C., Villén, J., Beausoleil, S. A., Bakalarski, C. E., Elledge, S. J., Gygi, S. P. A quantitative atlas of mitotic phosphorylation. Proc Natl Acad of Sci U S A. 105 (31), 10762-10767 (2008).
- Rona, G., Marfori, M., Borsos, M., Scheer, I., Takacs, E., Toth, J., Babos, F., Magyar, A., Erdei, A., Bozoky, Z., Buday, L., Kobe, B., Vertessy, B. G. Phosphorylation adjacent to the nuclear localization signal of human dUTPase abolishes nuclear import: structural and mechanistic insights. Acta Cryst D. 69 (12), 2495-2505 (2013).
- Harreman, M. T., Kline, T. M., Milford, H. G., Harben, M. B., Hodel, A. E., Corbett, A. H. Regulation of nuclear import by phosphorylation adjacent to nuclear localization signals. J Biol Chem. 279 (20), 20613-20621 (2004).
- Kosugi, S., Hasebe, M., Tomita, M., Yanagawa, H. Systematic identification of cell cycle-dependent yeast nucleocytoplasmic shuttling proteins by prediction of composite motifs. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (25), 10171-10176 (2009).
- McLachlin, D. T., Chait, B. T. Analysis of phosphorylated proteins and peptides by mass spectrometry. Curr Opin Chem Biol. 5 (5), 591-602 (2001).
- Van Berkel, G. J., Glish, G. L., McLuckey, S. A. Electrospray ionization combined with ion trap mass spectrometry. Anal Chem. 62 (13), 1284-1295 (1990).
- Hodel, A. E., Harreman, M. T., Pulliam, K. F., Harben, M. E., Holmes, J. S., Hodel, M. R., Berland, K. M., Corbett, A. H. Nuclear localization signal receptor affinity correlates with in vivo localization in Saccharomyces cerevisiae. J Biol Chem. 281 (33), 23545-23556 (2006).
- Hong, K. U., Kim, H. -. J., Kim, H. -. S., Seong, Y. -. S., Hong, K. -. M., Bae, C. -. D., Park, J. Cdk1-Cyclin B1-mediated Phosphorylation of Tumor-associated Microtubule-associated Protein/Cytoskeleton-associated Protein 2 in Mitosis. J Biol Chem. 284 (24), 16501-16512 (2009).
- Meraldi, P., Lukas, J., Fry, A. M., Bartek, J., Nigg, E. A. Centrosome duplication in mammalian somatic cells requires E2F and Cdk2–Cyclin A. Nature Cell Biol. 1, 88 (1999).
- Heuvel, S., Harlow, E. Distinct roles for cyclin-dependent kinases in cell cycle control. Science. 262 (5142), 2050-2054 (1993).
- Kinoshita, E., Kinoshita-Kikuta, E., Takiyama, K., Koike, T. Phosphate-binding Tag, a New Tool to Visualize Phosphorylated Proteins. Mol Cell Proteomics. 5 (4), 749-757 (2006).
- Takeda, H., Kawasaki, A., Takahashi, M., Yamada, A., Koike, T. Matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry of phosphorylated compounds using a novel phosphate capture molecule. Rapid Commun Mass Spectrom. 17 (18), 2075-2081 (2003).
- Linder, M. I., Köhler, M., Boersema, P., Weberruss, M., Wandke, C., Marino, J., Ashiono, C., Picotti, P., Antonin, W., Kutay, U. Mitotic Disassembly of Nuclear Pore Complexes Involves CDK1- and PLK1-Mediated Phosphorylation of Key Interconnecting Nucleoporins. Dev Cell. 43 (2), (2017).
- Arai, T., Haze, K., Iimura-Morita, Y., Machida, T., Iida, M., Tanaka, K., Komatani, H. Identification of β-catenin as a novel substrate of polo-like kinase 1. Cell Cycle. 7 (22), 3556-3563 (2008).
- Hansen, D. V., Tung, J. J., Jackson, P. K. CaMKII and Polo-like kinase 1 sequentially phosphorylate the cytostatic factor Emi2/XErp1 to trigger its destruction and meiotic exit. Proc Natl Acad of Sci U S A. 103 (3), 608-613 (2006).
- Zhang, Y., Dong, Z., Nomura, M., Zhong, S., Chen, N., Bode, A. M., Dong, Z. Signal Transduction Pathways Involved in Phosphorylation and Activation of p70S6K Following Exposure to UVA Irradiation. J Biol Chem. 276 (24), 20913-20923 (2001).
- Richard, D. E., Berra, E., Gothié, E., Roux, D., Pouysségur, J. p42/p44 Mitogen-activated Protein Kinases Phosphorylate Hypoxia-inducible Factor 1α (HIF-1α) and Enhance the Transcriptional Activity of HIF-1. J Biol Chem. 274 (46), 32631-32637 (1999).
