Bu iletişim kuralı sözlü olarak ortaya çıkarmak ve bakteriyel patojenler ile meyve sineği Drosophila melanogaster bulaştırmak ve bağırsak enfeksiyonu takip bulaşıcı bakteri döken sayısını ölçmek için yöntemler açıklanır. Daha fazla sinek hayatta kalma sözlü bakteriyel enfeksiyonu takip bağışıklık mutantlar etkisini açıklar.
Meyve sineği Drosophila melanogaster enfeksiyon ve doğuştan gelen bağışıklık en gelişmiş modeli sistemlerinden biridir. Çoğu iş sistemik enfeksiyonlar üzerinde odaklanmıştır iken, gut immunocompetence sözlü olarak sinekler bulaştırmak için yöntemler gerektirir patojenlere mekanizmaları ilgi son bir artış olmuştur. Burada sözlü olarak bireysel sinekler bir fırsatçı bakteriyel patojen (Pseudomonas aeruginosa) ve D. melanogaster (Pseudomonas entomophila) doğal bir bakteriyel patojen ortaya çıkarmak için bir iletişim kuralı mevcut. Erkek ve dişi sinekler bu patojenler için ortaya çıkarmak için sağlam bir yöntem sağlamak amacıyla bu iletişim kuralı hedefidir. Biz hayatta kalma fenotipleri, mikrop yükler ve dökülme, bakteriyel gösteren temsilcisi sonuçları hangi heterojenite patojen iletim çalışmanın ilgilidir sağlar. Son olarak, biz bunu teyit (bağırsak epitel koruyucu peritrophic matrisinde eksik) Dcy mutantlar ve zevkle (fonksiyonel bağışıklık yetersizliği (IMD) yolu eksik) mutantlar, oral enfeksiyon bakteri artan duyarlılık göstermek. Bu iletişim kuralı, bu nedenle, bağırsak enfeksiyonu sonuçları ve bakteriyel iletim varyasyon bir çeşitli genetik ve çevresel kaynakları çalışma genişletilmiş enfeksiyonu ağız yolu kullanmanın sinekler bulaştırmak için sağlam bir yöntem açıklanır.
Meyve sineği (sirke sineği olarak da bilinir) D. melanogaster, kapsamlı bir model organizma enfeksiyon ve patojenler1,2çeşitli karşı bağışıklık için kullanılmıştır. Bu eser enfeksiyon fizyolojik sonuçlarını temel anlayışlar teklif etti ve ayrıca konak immün yanıt parasitoid, bakteriyel, fungal ve viral enfeksiyonlara karşı temel moleküler yolları çözülüyor öncü oldu. Bu bilgi sadece doğuştan gelen bağışıklık yanıtı böcek ve diğer omurgasızlar anlamak yararlı değil, ama çünkü birçok bağışıklık mekanizmaları örümceklerle böcekler ve memeliler arasında korunmuş, Drosophila de keşif mahmuzlu vardır büyük bağışıklık mekanizmaları memelilerde, insanlar3dahil.
Çoğu çalışma Drosophila enfeksiyon ve Dokunulmazlık patojenler doğrudan böcek gövdesine iğneleyici veya enjeksiyon4,5,6tarafından teslim aşılama yöntemleri kullanarak sistemik enfeksiyonlar odaklanmıştır. Bu yöntemler içinde kontrollü bir bulaşıcı doz teslimini bırakmak açık ve sistemik enfeksiyonlar çalışmalarına büyük bir vücut tarafından desteklenen avantajdır. Ancak, birçok doğal olarak meydana gelen bakteriyel patojenler D. melanogaster , organik madde nerede gut immunocompetence konak savunma7,8‘, önemli bir rol oynamaktadır çürüyen besleme yoluyla iktisap 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15. sistemik enfeksiyonlar istihdam deneyler bu savunma yan yol ve, bu nedenle, nasıl doğal patojenlere karşı savunma böcekler mount tamamen farklı bir resim sağlar. Bu çalışmanın amacı, ekoloji ve evrim enfeksiyon, hakkında tahminler test etmek doğal patojenler kullanımı ve yolları enfeksiyonunun önemli16,17nerede olduğunu özellikle uygundur. Son çalışmaları önemli ölçüde patojenler tarafından izlenen yolu hastalığı sonucu18,19etkilemesi vurgulanmış bulunmaktadır, farklı bağışıklık yolları20,21aydınlığa çıkartıyor, koruyucu etkisini belirlemek için Endosymbionts16miras ve hatta oyun ana savunma17gelişiminde önemli bir rol olabilir.
Sözlü yolları enfeksiyonu istihdam için bir başka neden bu varyasyon incelenmesi patojen iletimde bakteri dışkı atılımı oral enfeksiyon22,23, takip sırasında shedding ölçerek sağlanmıştır 24. hastalık iletim ana bilgisayar heterojenlik kaynaklarının anlama doğal nüfus25,26yılında zorlu, ancak iletim, patojen, altında kontrollü laboratuvar dökülme gibi bileşenleri ölçme koşulları yararlı alternatif yaklaşım27sağlamaktadır. Besleme sinekler bakteri ve ölçüm bakteriyel altında kontrollü deneysel koşullar genetik ve çevresel bağlamlarda çeşitli dökülme, iletim ana bilgisayarları arasında varyasyon kaynakları tanımlamak mümkündür.
Burada, biz sözlü olarak D. melanogaster bakteriyel patojenler ile hastalık için bir iletişim kuralı tanımlamak ve bakteriyel büyüme miktarının ve dökülme için bu (Şekil 1) izler. Biz bu protokol üzerinde iki Pseudomonas bakterileri tarif: zehirli bir fırsatçı patojen P. aeruginosa (PA14) suşu ve doğal patojen P. entomophilasinek daha az öldürücü bir tür. Psödomonadlar böcekler, nematod, bitkiler ve omurgalı, hastalık bir geniş ana bilgisayar aralığıyla ortak Ayagin Gram-negatif bakteriler ve çoğu ortamlarda4,6‘. Drosophila P. aeruginosa ve P. entomophila tarafından enterik enfeksiyon patolojisi bağırsak epiteli12,13,14,–15sonuçları, 28. Biz bu iki bakteriyel patojenler üzerinde odaklanmak iken, yöntem tanımlamak burada prensip olarak küçük değişiklikler ile ilgi herhangi bir bakteriyel pathogen uygulanabilir. Sözlü pozlama, biz sonrası enfeksiyon hayatta kalma ölçmek ve bireysel sinek içinde mikrop yükü ölçmek ve birimleri (CFUs) oluşturan colony ifade ortamına uygun mikroplar döken. Çünkü bağırsak immunocompetence epitel bariyer ve humoral yanıt bir arada gelen sonuçlar, son olarak, aynı zamanda sinek satırları nerede bu savunma kesintiye yaşama ölçeriz. Özellikle, Drosocrystallin (Dcy) mutantlar daha önce gösterilmiştir sözlü bakteriyel enfeksiyon nedeniyle tükenmiş peritrophic matris29gut daha duyarlı olmak. Ayrıca hayatta kalma yolu ile IMD yolu30gram-negatif bakteri karşı antimikrobiyal peptidler üreten engellemiştir bir çeşni (Rel) mutant ölçüyoruz.
Biz güvenilir bir şekilde sözlü olarak D. melanogaster bakteriyel patojenler ile hastalık için bir iletişim kuralı mevcut. Biz P. aeruginosa ve P. entomophilaodaklanmak, ama bu protokolü kolayca diğer bakteriyel türler Örneğin, Serratia marcescens7. enfeksiyonu etkinleştirmek için adapte edilebilir Bu iletişim kuralının temel yönlerini bakteriyel türler arasında değişir. Buna göre en verimli bulaşıcı doz, karşılık gelen virülans ve ana genotip duyarlılık tüm kabul ve ideal olarak test pilot çalışmalar. Optik yoğunlukları çeşitli bakteri kültürleri uçmaktadır teşhir ve onların bulaşıcı doz ve hayatta kalma ölçme yeni bakteriyel türler veya sinek hatları ile çalışırken uygun bir başlangıç noktası olabilir.
İletişim kuralı adımları gibi açlık besleme önce sinek ve yeniden askıya bakteriyel granül %5 sükroz çözümde oral enfeksiyon sıradan ve pozlama7,8, sırasında bakteriyel enfeksiyon güvenilirliğini artırmak 9 , 10. ancak, pozlama sırasında sinekler aslında bakteri kültürü bir yüzey üzerinde yaşamak unutmamak önemlidir. Bu kültür üzerinde yürüme sürecinde, bakteri sinek ‘s yüzeyi, özellikle manikür veya çevresinde kıllar24teslim olmak. Epicuticular bu bakteri, başarılı bir enterik enfeksiyon yansıtmıyor ama hala sinek homojenizasyon ve kaplama tarafından algılanan. Yanlış pozitif olasılığını azaltmak için o yüzeye esastır sinekler % 70 etanol için 1 dakikaya kadar daldırma yoluyla sterilize.
Oral enfeksiyon bakteri dökülme oranları dikkate alınarak, esastır. Bir ana bilgisayar ortamına bültenleri patojenler sayısı genellikle ölçmek zordur ve dahili yük kez enfeksiyon ve bu nedenle iletim26,27şiddeti için bir proxy olarak kabul edilir. Bakteri dökülme yanında ölçüm bakteri yükü incelenmesi hastalığın şiddeti ve yaymak38bu iki önemli bileşenleri arasında ilişki sağlar. Yöntemi sunulan bir sınırlama sinekler iç bakteri yükünü raporlaması yıkıcı örnekleme gerektirmesidir. Bu zor uzunlamasına eğilimleri patojen büyüme ve izni aynı birey içinde araştırmak yapar. Ancak, ortalama mikrop yükü her kohort boyuna patojen dynamics verilen herhangi içinde yansıtır varsayımı altında enfeksiyon farklı aşamalarında bireylerin destructively örnekleme kohortlardan tarafından bu sınırlamayı aşmak mümkündür bireysel. Bakteri dökülme aynı kısıtlamalarla acı değil ve biz nasıl dökülme kesitsel bir örnek veya boyuna nasıl dökülme içinde tek bir zaman içerisinde değişen araştırmak için sayısal örnekleri sunuyoruz.
Birçok ev sahibi ve patojen özelliği ortaklaşa hastalık25,26,39iletimi için bireyin eğilimi belirlemek. Bu özellikler büyük olasılıkla önemi ana bilgisayar-patojen sistemleri arasında değişir, dökülme büyük olasılıkla önemli bir belirleyici fekal-oral iletim iken. Bakteri dökülme ölçmek için yetenek bu varsayımı test etme olanağı açar. Ana bilgisayar-patojen dynamics sinek satırlarının istenen bir panel ile karakterize, Denemecileri sözlü olarak bireyler bulaştırmak ve bulaşmamış, duyarlı ev sahibi bulaşıcı kendi dönemlerinde koyun. ‘Alıcı’ Bu sinekler sonra doğrudan iletim ölçmenin bir yolu olarak çeşitli zaman noktalarda iç bakteriyel yük denetlesinler.
Dokunulmazlık, enfeksiyon ve evrim (http://ciie.bio.ed.ac.uk; Hibe Başvuru no. 095831) için bu iş merkezi için Wellcome Trust stratejik bir ödülü tarafından desteklenmiştir. PFV Branco Weiss arkadaş grubu (https://brancoweissfellowship.org/) ve bir Başkan’ın bursu (Biyolojik Bilimler, University of Edinburgh) tarafından desteklenmiştir JASJ NERC E3 DTP doktora öğrencilik tarafından desteklenmiştir.
Vials | Sarstedt Ltd. | 58.490 | Polystyrene flat base tube 75mm x 23.5mm, 23ml |
Agar | Sigma-Aldrich | A7002 | Agar, ash 2.0-4.5% |
Brown sugar | Bidvest | 66032 | Light brown soft sugar |
Maize | Dove's Farm | Organic maize flour | |
Fermipan yeast | Bidvest | 96360 | Dry, instant yeast |
Methyl-4-hydroxybenzoate | Sigma-Aldrich | H5501 | >=99.0%, crystalline |
Sucrose | Sigma-Aldrich | 84097 | Sucrose BioUltra, for molecular biology, >=99.5% (HPLC) |
Petri dishes | Fisher Scientific UK Ltd. | 15788517 | X600 Petri Dish 90 X 16.2MM Sterile Triple Vent |
Falcon tubes (50ml) | Greiner Bio-one Inc | 210261 | Centrifuge tube, 50ml, skirted, bagged, sterile |
Eppendorf tube (0.5ml) | Sarstedt Ltd. | 72.699 | Sarstedt Micro Tube Conical Base Push Cap 0.5ml Standard Neutral |
Eppendorf tube (1.5ml) | Sarstedt Ltd. | 72.690.001 | Sarstedt Micro Tube Conical Base Push Cap 1.5ml Standard Neutral |
Ethanol | VWR International Ltd. | 20821.33 | ETHANOL ABSOLUTE ANALAR NP ACS/R.PE – Analytical Grade |
2 L Conical Flask | VWR International Ltd. | 214-0038 | Narrow neck, 2 L Erlenmeyer flask |
Sterile filter paper | Fisher Scientific UK Ltd. | 1001-020 | Plain circle and sheets; Particle Retention: greater than11um; Filtration speed: 150 herzberg; Air flow: 10.5s/100mL/in2; Medium porosity; Smooth surface; Grade 1; Type: circle; Dia: 20mm |
Bijou sample container | Fisher Scientific UK Ltd. | 129A | 7ml polystyrene sample container |
Pseudomonas isolation agar | Sigma-Aldrich | 17208 | Contains agar 13.6 g/L, magnesium chloride 1.4 g/L, peptic digest of animal tissue 20g/L, potassium sulfate 10g/L, triclosan 0.025g/L |
LB broth, Miller | Fisher Scientific UK Ltd. | BP1426 | Contains 10g tryptone, 5g yeast extract, 10g sodium chloride per litre |
Large Embryo Collection Cages | Scientific Laboratory Supplies Ltd. | 59-101 | Flystuff- fits 100mm petri dish |
TRI reagent solution | Life Technologies | AM9738 | |
96-well microplate | Scientific Laboratory Supplies Ltd. | 353072 | Falcon 96 Well Clear Flat Bottom TC-Treated Polystyrene Cell Culture Microplate with Lid Sterile |
Pestle | Fisher Scientific UK Ltd | 12649595 | Pestle, Presterilized; Axygen; Tissue grinder; Blue; Inert polypropylene construction; Fits 1.5 and 2.0mL centrifuge tubes; Individually wrapped; 100/Pk |
Glycerol | Scientific Laboratory Supplies Ltd. | CHE2068 | Glycerol A.R. 99.5% 2.5 L |
Cotton wool- non absorbent | Cowens Ltd | ABL | Non Absorbent Large quantity 20 bags x 500 |
Cotton wool- absorbent | Cowens Ltd | ABS | BP small quantity 20 bags x 500 |
Vortex | Fisherbrand | Whirlimixer 75W 50-6-Hz 220-240V | |
Orbital incubator | Gallenkamp | INR-200-010V | 220 V, 50 Hz, 5 A. Nominal temperature: 70ºC. Shaking frequency: 0…400 rpm. |
Absorbance Microplate Reader | Biotek Instruments Ltd | ELx808™ Absorbance Microplate Reader | |
Gen 5 Microplate Reader and Imager Software | Biotek Instruments Ltd | For Absorbance Microplate Reader | |
Centrifuge | Beckman Coulter | 392304 | Allegra X-12R Benchtop Centrifuge, refridgerated 50Hz 230V |
Step One Plus Real Time qPCR System | Thermofisher Scientific | 4376600 | Applied biosystems Step One Plus real time qPCR system |
Step One Software 2.3 | Thermofisher Scientific | For Stepone and SteponePlus real time qPCR systems | |
R Statistical Software | https://cran.r-project.org/ | ||
10 µL pipette tips | Greiner Bio-one Inc | 741015 | Easlyload gilson-style. Graduated, clear, refill, 960 pcs |
200 µL pipette tips | Greiner Bio-one Inc | 741065 | Easlyload gilson-style. Graduated, clear, refill, 960 pcs |
1000 µL pipette tips | Greiner Bio-one Inc | 741045 | Easlyload gilson-style. Graduated, clear, refill, 960 pcs |
20 µL filtered pipette tips | Greiner Bio-one Inc | 774288 | Filter tip gilson-style. Clear, rack blue, single packed, R/Dnase free, 10 racks of 96pcs |
200 µL filtered pipette tips | Greiner Bio-one Inc | 739288 | Filter tip gilson-style. Clear, rack blue, single packed, R/Dnase free, 10 racks of 96pcs |
1000 µL filtered pipette tips | Greiner Bio-one Inc | 740288 | Filter tip gilson-style. Clear, rack blue, single packed, R/Dnase free, 10 racks of 60pcs |