Aislamiento de células Stromal Endometrial humanas In Vitro Decidualization
Summary
Este estudio presenta un procedimiento optimizado y validado para el aislamiento y cultivo de células stromal endometriales humanas para llevar a cabo análisis de decidualization en vitro . Además, este estudio proporciona un método detallado para eficiente precipitación un gen específico usando siRNA en células stromal endometriales humanas.
Abstract
La diferenciación de células stromal endometriales humanas (HESC) de fibroblasto-como aspecto en decidua secretor es una transformación necesaria para la implantación del embrión en el revestimiento del útero de la matriz materna. Decidualization incorrecta se ha establecido como una causa de fallo de implantación y posterior aborto espontáneo del embrión temprano. Por lo tanto, entender los mecanismos moleculares subyacentes decidualization es ventajoso mejorar el índice de nacimientos exitosos. En vivo basado en estudios de decidualization artificial a menudo se limitan debido a dilemas éticos asociados a la investigación en humanos, así como complicaciones traslacionales en modelos animales. Como resultado, en vitro ensayos a través de cultivo celular primario son utilizados a menudo para explorar la modulación del decidualization a través de las hormonas. Este estudio proporciona un protocolo detallado para el aislamiento de células y posterior decidualization artificial mediante la suplementación de hormonas al medio de cultivo. Además, este estudio proporciona un método bien diseñado para caída cualquier gen de interés utilizando siRNA basado en lípidos transfecciones. Este protocolo permite la optimización de la pureza de la cultura, así como rendimiento del producto, maximizando así la capacidad para utilizar este modelo como un método confiable para entender los mecanismos moleculares subyacentes decidualization y la posterior cuantificación de agentes secretados por las células estromales del endometrio decidualized.
Introduction
Entre las etapas de la menarquia y la menopausia, las mujeres en edad reproductiva se someten a ciclos mensuales de la proliferación endometrial regulados por hormonas, la diferenciación y el posterior vertimiento en preparación para el embarazo en un proceso conocido como menstruación1 ,2. Las modificaciones físicas del endometrio humano son necesarias para la implantación adecuada del embrión en la pared uterina1. Alteraciones del endometrio, incluyendo adaptaciones tanto morfológicas como bioquímicas, son mediadas a través del ciclo menstrual a través de las hormonas esteroides ováricas estrógenos y progesterona (P4)3,4,5. Dentro de la fase proliferativa (o folicular), los niveles de estrógenos preovulatorio aumento, Inicio de engrosamiento del endometrio. Después de la ovulación, la fase secretora (o luteínica) promueve un aumento significativo en las concentraciones de P4, induciendo la transformación morfológica de células stromal endometriales (ESC) de aspecto fibroblasto-como redondeadas, epitelial-como las células decidual en un proceso conocido como decidualization4,6. Decidualization incorrecta se ha establecido como una causa de fracaso de implantación y posterior temprano embrión aborto4,7,8. Por lo tanto, entender los mecanismos moleculares subyacentes decidualization es ventajoso para el diagnóstico y tratamiento de la pérdida temprana del embarazo.
Actualmente, se utilizan varias metodologías para explorar los efectos subyacentes del decidualization en células stromal endometriales. In vivo, el útero de ratón puede ser inducida artificialmente para decidualization mediante estimulación mecánica (es decir, arañazos) o aceite de inyección en un útero preparado hormonal9. Distinto de los seres humanos, esta estimulación sintética promueve la diferenciación del lumen uterino proporcionando la apariencia de la presencia de blastocistos, un paso que se requiere para la iniciación del decidualization en roedores10,11. En consecuencia, debido a las complicaciones traslacionales asociadas con modelos animales y los dilemas éticos que rodean en vivo basado en estudios en seres humanos, con más éxito se estudian modelos decidualization basado en vitro.
En este estudio, los sujetos son reclutados a través de la colocación de anuncios en dos periódicos locales de inglés y español. Temas identificados como candidatos adecuados para este estudio se traen adentro para reunirse con el Coordinador de la investigación, en el que se discuten una divulgación completa de los riesgos potenciales. Sobre la confirmación de una comprensión completa de los riesgos potenciales involucrados, consentimiento de los sujetos se logró en forma escrita y verbal. Consentimiento del sujeto incluye permiso (1) almacenamiento (2) a largo plazo de flebotomía de sus tejidos para la investigación futura y (3) de acuerdo a la creación de cultivos primarios de muestras de tejido recogidas. Después de consentimiento, temas reciben un formulario para completar en que líos permitidos de raza/origen étnico y el derecho de confidencialidad. Una visita subsecuente está programada para obtener la biopsia de endometrio basada en el ciclo menstrual del sujeto. Voluntarios reclutados en este estudio reflejan la demografía étnica y racial de la región metropolitana de St. Louis como se documenta en el censo 2012 y no implicó la participación de todas las poblaciones vulnerables incluyendo mujeres embarazadas, fetos, embriones, niños menores de 18 años de edad, o de otros grupos vulnerables. Requisitos de elegibilidad para la participación en la toma de muestras de biopsia incluyen (1) ser entre las edades de 18-45 años (2) tener ciclos menstruales regulares (días 25-32) (3) no tener ningún embarazo actual o uso de dispositivo intrauterino/hormonales anticonceptivos 30 días antes de la inscripción (4) no actual infección vaginal o enfermedades de transmisión sexual (5) que no los tratamientos antibióticos actuales y (6) no que actual citología vaginal anormal.
Dentro de este estudio, las células stromal endometriales humanas (HESCS) son cultivadas y artificialmente inducidas a decidualization en vitro a través de la suplementación de hormonas (estradiol (E2), acetato de medroxiprogesterona (MPA) y adenosina cíclica monofosfato (cAMP)) al medio. En este método, el grado de decidualization se altera en base en el número total de días de tratamiento hormonal. Junto con el cambio de citoesqueleto, suplementación hormonal induce adaptaciones bioquímicas en el cual las células decidual experimentan cualidades secretores como2,4. La expresión de genes de la seña de identidad, como la prolactina (PRL) y la proteína de unión a factor de crecimiento insulínico tipo 1 (IGFBP1), puede ser utilizada para confirmar y cuantificar el grado de HESCS decidualization5,12, 13 , 14. lo importante, también se demuestra la viabilidad de este protocolo para llevar a cabo la caída específica del gene.
Protocol
Representative Results
Discussion
El ciclo menstrual reproductivo femenino se caracteriza por un aumento en los niveles de progesterona durante la fase lútea, de tal modo induciendo el decidualization del ESC en Ronda, epiteliales como células secretoras3,8. La iniciación del decidualization es especie dependiente. En los seres humanos, decidualization se produce espontáneamente tras el aumento de la concentración de progesterona, mientras que ratones requieren presencia de blastocistos<sup …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores no tienen nada que revelar.
Materials
| Opti-MEM I (1X) Reduced Serum Medium | Gibco | 31985-070 | For decidualization media |
| DMEM / F12 (1:1) (1X) | Gibco | 11330-032 | |
| Trypan Blue Stain (0.4%) | Gibco | 15250-061 | For cell count |
| PureLink RNA Mini Kit | Invitrogen | 12183018A | For RNA Isolation/Purification |
| TaqMan 2X Universal PCR Master Mix | Applied Biosystems | 4304437 | |
| High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit | Applied Biosystems | 4374967 | |
| Eukaryotic 18S rRNA Endogenous Control | Life Technologies | 4319413E | For qPCR internal control |
| TaqMan Gene Expression Assay Prolactin Probe | Applied Biosystems | 4331182 | For qPCR internal control |
| TaqMan Gene Expression Assay IGFBP1 Probe | Applied Biosystems | 4331182 | For qPCR internal control |
| Phalloidin-iFluor 488 Reagent – CytoPainter | Abcam | ab176753 | |
| Human Prolactin ELISA Kit | Invitrogen | EHIAPRL | |
| 16% Paraformaldehyde | Alfa Aesar | 30525-89-4 | Fixative |
| Lipofectamine RNAiMAX | Invitrogen | 13778150 | Transfection Reagent |
| ProLong Gold antifade reagent with DAPI | Invitrogen | P36935 | For mounting |
| 0.25% Trypsin-EDTA (1X) | Gibco | 25200-056 | |
| Penicillin Streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| Charcoal Stripped Fetal Bovine Serum | Sigma | F6765-500ML | |
| Sodium Bicarbonate (7.5%) | Gibco | 25080-094 | |
| Ficoll-Paque PLUS Reagent | Fisher Scientific | 45001749 | |
| Collagenase from Clostridium histolyticum | Sigma | C0130-1G | |
| Deoxyribonuclease I from bovine pancreas | Sigma | DN25-100MG | |
| Medroxyprogesterone 17-acetate | Sigma | M1629-1G | For EPC Media |
| Estradiol | Sigma | E1024-1G | For EPC Media |
| cAMP | Sigma | A6885-100MG | For EPC Media |
| Fine straight stitch scissors | Fine Science Tools | 15396-00 | |
| TaqMan Gene Expression Assay NCOA2 Probe | Applied Biosystems | 4351372 | |
| Fetal Bovine Serum, heat inactivated | Gibco | 10-082-147 | |
| Antibiotic-antimycotic | Thermo Scientific | 15240062 | |
| Hank’s Balanced Salt Solution | Corning | 21-021-cv | |
| 50 mL conical polypropylene Falcon tube | Corning | 352098 | |
| Dumont #5/45 Forceps | Fine Science Tools | 11251-35 | |
| 100 x 15 mm Glass Petri dish | VWR | 75845-546 | |
| 40 micron cell strainer | Midsci | 229481 | |
| Isotemp 215 Water bath | Fisher Scientific | FS-215 | |
| LSE Centrifuge | Corning | 6755 | |
| Human NCOA2 siRNA | Dharmacon | L-020159-00 | Gene specific qPCR probe |
| Steri-cycle i160 CO2 Incubator | Thermo Scientific | 51030301 | |
| NanoDrop 2000 | Thermo Scientific | ND-2000 | For RNA quantification |
| Phosphate Buffered Saline | Fisher Scientific | 50146771 | |
| 75 cm Canted Neck Cell Culture flask | Corning | 430641U | |
| 6 well Non-Pyrogenic Cell Culture Plate | Corning | 3506 | |
| Pipet Controller Ultra | Corning | 4099 | |
| Photoshop | Adobe | 19.0.1.334 | |
| 25 cm Canted Neck Cell Culture flask | Corning | 7200876 | |
| Triton X-100 | Sigma | X100-1L | |
| 15 mL conical polypropylene Falcon tube | Corning | 352099 | |
| 10 mL Syringe | BD | 302995 | |
| 1300 Series A2 Biological Safety Hood | Thermo Scientific | 1377 | |
| accuspin Micro17 centrifuge | Fisher Scientific | 13100675 | |
| 7500 Fast real time PCR system | Applied Biosystems | 3052632 | |
| EVOS FL Immunofluorescence Microscope | Life Technologies | 01414-155G-291 | |
| Leica Inverted Light Microscope | Leica | DMi1 | |
| Illrustrator | Adobe | 22.0.1.253 | |
| Excel Spreadsheets | Microsoft | 2016 | |
| Deckglaser 18 mm cover glasses | NeuVitro | GG-18 | |
| Reichert Bright-Line Hemacytometer | Sigma | Z359629-1EA | |
| 2-mercaptoethanol | Fisher Bioreagents | BP176-100 | For RNA lysis buffer |
| 1.2mL External Threaded Polypropylene Cryogenic Vial | Corning | 430658 | For freezing HESC cells |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Sigma | D2650-100mL | For freezing media |
Referências
- Maruyama, T., Yoshimura, Y. Molecular and cellular mechanisms for differentiation and regeneration of the uterine endometrium. Endocrine Journal. 55, 795-810 (2008).
- Yu, J., et al. Endometrial Stromal Decidualization Responds Reversibly to Hormone Stimulation and Withdrawal. Endocrinology. 157, 2432-2446 (2016).
- Ahn, J. I., et al. cAMP-Response Element-Binding 3-Like Protein 1 (CREB3L1) is Required for Decidualization and its Expression is Decreased in Women with Endometriosis. Current Molecular Medicine. 16, 276-287 (2016).
- Gellersen, B., Brosens, J. J. Cyclic decidualization of the human endometrium in reproductive health and failure. Endocrine Reviews. 35, 851-905 (2014).
- Telgmann, R., Gellersen, B. Marker genes of decidualization: activation of the decidual prolactin gene. Human Reproduction Update. 4, 472-479 (1998).
- Camden, A. J., et al. Growth regulation by estrogen in breast cancer 1 (GREB1) is a novel progesterone-responsive gene required for human endometrial stromal decidualization. Molecular Human Reproduction. 23, 646-653 (2017).
- Kommagani, R., et al. The Promyelocytic Leukemia Zinc Finger Transcription Factor Is Critical for Human Endometrial Stromal Cell Decidualization. PLoS Genetics. 12, e1005937 (2016).
- Large, M. J., DeMayo, F. J. The regulation of embryo implantation and endometrial decidualization by progesterone receptor signaling. Molecular and Cellular Endocrinology. 358, 155-165 (2012).
- Zhang, X. H., et al. The mesenchymal-epithelial transition during in vitro decidualization. Reproductive Sciences. 20, 354-360 (2013).
- Kommagani, R., et al. Acceleration of the glycolytic flux by steroid receptor coactivator-2 is essential for endometrial decidualization. PLoS Genetics. 9, e1003900 (2013).
- Ramathal, C. Y., Bagchi, I. C., Taylor, R. N., Bagchi, M. K. Endometrial decidualization: of mice and men. Seminars in Reproductive Medicine. 28, 17-26 (2010).
- Tamura, I., et al. Novel Function of a Transcription Factor WT1 in Regulating Decidualization in Human Endometrial Stromal Cells and Its Molecular Mechanism. Endocrinology. 158, 3696-3707 (2017).
- Vinketova, K., Mourdjeva, M., Oreshkova, T. Human Decidual Stromal Cells as a Component of the Implantation Niche and a Modulator of Maternal Immunity. Journal of Pregnancy. , 8689436 (2016).
- Wu, D., et al. Chronic endometritis modifies decidualization in human endometrial stromal cells. Reproductive Biology and Endocrinology. 15, 16 (2017).
- Garcia-Elias, A., et al. Defining quantification methods and optimizing protocols for microarray hybridization of circulating microRNAs. Scientific Reports. 7, 7725 (2017).
- Brosens, J. J., et al. Human endometrial fibroblasts immortalized by simian virus 40 large T antigen differentiate in response to a decidualization stimulus. Endocrinology. 137, 2225-2231 (1996).
- Koukouritaki, S. B., Margioris, A. N., Gravanis, A., Hartig, R., Stournaras, C. Dexamethasone induces rapid actin assembly in human endometrial cells without affecting its synthesis. Journal of Cellular Biochemistry. 65, 492-500 (1997).
