Isolamento de células do estroma Endometrial humanas para In Vitro Decidualization

Resumo

Este estudo apresenta um processo otimizado e validado para o isolamento e a cultura de células do estroma endometriais humanas para realizar o ensaio de decidualization em vitro . Além disso, este estudo fornece um método detalhado para eficientemente "knockdown" um gene específico usando siRNAs em células do estroma endometriais humanas.

Resumo

A diferenciação das células do estroma endometriais humanas (HESC) da aparência de um fibroblasto em secretora decidua é uma transformação necessária para a implantação do embrião no revestimento do útero do ventre materno. Decidualization impróprio foi estabelecida como das causas para a falha de implantação e subsequente aborto precoce do embrião. Portanto, compreender os mecanismos moleculares subjacentes decidualization é vantajoso melhorar a taxa de nascimentos bem sucedidos. In vivo com base em estudos de decidualization artificial estão limitando muitas vezes devido a dilemas éticos associadas à investigação humana, bem como complicações translacionais em modelos animais. Como resultado, em vitro ensaios através de cultura de células primárias são frequentemente utilizados para explorar a modulação de decidualization através de hormônios. Este estudo fornece um protocolo detalhado para o isolamento de HESC e subsequente decidualization artificial através da suplementação de hormônios para o meio de cultivo. Ainda mais, este estudo fornece um método bem projetado para nocaute qualquer gene de interesse utilizando transfections de siRNA baseadas em lipídios. Este protocolo permite a otimização da pureza da cultura, bem como rendimento de produto, maximizando assim a capacidade de utilizar este modelo como um método confiável para compreender os mecanismos moleculares subjacentes à decidualization e a posterior quantificação dos agentes secretados pelas células do estroma endometriais decidualized.

Introdução

Entre os estágios da menarca e menopausa, as mulheres em idade reprodutiva sofrem ciclos mensais de proliferação endometrial hormônio-regulada, diferenciação e subsequente derramamento em preparação para a gravidez em um processo conhecido como menstruação^{1 ,2}. Tais modificações físicas do endométrio humano são necessárias para a implantação do embrião adequado para a parede uterina¹. Alterações do endométrio, incluindo adaptações morfológicas e bioquímicas, são mediadas por todo o ciclo menstrual através de hormônios esteroides ovarianos estrógeno e progesterona (P4)^....

Protocolo

Todas as biópsias de endométrio humano coletadas para este estudo foram alcançadas na Universidade de Washington em St. Louis, departamento de obstetrícia e Ginecologia usando um institucional Review Board (IRB) aprovou o formulário de consentimento por escrito.

1. preparação

1. Prepare 500 mL de 1 x do Hank equilibrado sal solução (HBSS) adicionando 100 U/mL penicilina e estreptomicina 100 de µ g/mL para o frasco contendo mídia (mais referenciado como meio HBSS +).
2. Preparar 500 mL de meio de águia de Dulbecco modificado: F-12 mistura de nutrientes (DMEM/F12) com vermelho de fenol, L-glutamina e 15mm 4-(2-hydroxyethyl)-1-pi....

Resultados

Decidualization em cultura HESC

Após isolamento, células do estroma endometriais humanas foram cultivadas a uma formação de monocamada com confluência de 80-90% e induzido para decidualization em vitro , tratando com 10 nM E2, 1 µM MPA e acampamento de 50 µM (EPC). Mudanças morfológicas associadas em vitro decidualization foram visualizadas na figura 1A. Sobre deci.......

Discussão

O ciclo menstrual reprodutivo feminino é caracterizado por um aumento nos níveis de progesterona durante a fase lútea, induzindo assim a decidualization de ESC em redondo, epitelial, como as células secretoras de^3,8. A iniciação de decidualization é dependente de espécies. Em humanos, decidualization ocorre espontaneamente sobre o aumento da concentração de progesterona, enquanto ratos requerem blastocisto presença^10,

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Opti-MEM I (1X) Meio de Soro Reduzido	Gibco	31985-070	Para meios de decidualização
DMEM / F12 (1:1) (1X)	Gibco	11330-032
Mancha Azul de Tripano (0,4%)	Gibco	15250-061	Para contagem de células
PureLink RNA Mini Kit	Invitrogen	12183018A	Para Isolamento/Purificação de RNA
TaqMan 2X Universal PCR Master Mix	Kit
	Applied Biosystems	4374967
endógeno eucariótico de 18S rRNA	Life Technologies	4319413E	para controle interno de qPCR
Ensaio de expressão gênica de TaqMan Sonda de prolactina	4331182	aplicada de biossistemas	para controle interno de qPCR
Expressão gênica de TaqMan A ponta de prova IGFBP1 do ensaio	aplicou 4331182 de Biosystems		para o reagente
Phalloidin-iFluor 488 do controle qPCR - CytoPainter	Abcam	ab176753
Prolactina humana ELISA Kit	Invitrogen	EHIAPRL
16% Paraformaldeído	Alfa Aesar	30525-89-4	Fixador
Lipofectamine RNAiMAX	Invitrogen	13778150	Reagente de transfecção
ProLong Gold reagente antidesbotamento com DAPI	Invitrogen	P36935	Para montagem
de 0,25% de tripsina-EDTA (1X)	Gibco	25200-056
Penicilina Estreptomicina	Gibco	15140-122
Carvão vegetal despojado Soro fetal bovino	Sigma	F6765-500ML
Bicarbonato de sódio (7,5%)	Gibco	25080-094
Ficoll-Paque MAIS	científica 45001749		Fisher
do histolyticum de Clostridium	Sigma	C0130-1G
Deoxyribonuclease mim do pâncreas bovino	Sigma	DN25-100MG
Medroxyprogesterone 17-acetato	Sigma	M1629-1G	para o meio Sigma
		de Estradiol da MPEE1024-1G	para mídia EPC
cAMP	Sigma	A6885-100MG	para mídia EPC
Tesoura de ponto reto fino	Ferramentas de ciência fina	15396-00
TaqMan Ensaio de expressão gênica NCOA2 Sonda	Applied Biosystems	4351372
Soro bovino fetal, inativado por calor	Gibco	10-082-147
Thermo antibiótico	Científico	15240062
Hank' s Solução salina balanceada	Corning	21-021-cv
50 mL polipropileno cônico Tubo Falcon	Corning	352098
Dumont #5/45 Fórceps	Fine Science Tools	11251-35
100 x 15 mm Placa de Petri de vidro	VWR	75845-546
Filtro de célula de 40 mícrons	Midsci	229481
Isotemp 215 Banho-maria	Fisher Scientific	FS-215
Centrífuga LSE	Corning	6755
SiRNA NCOA2 Humano	Dharmacon	L-020159-00	Sonda qPCR específica
do gene Incubadora de CO2 i160 de ciclo	Thermo Scientific	51030301
NanoDrop 2000	Thermo Scientific	ND-2000	Para quantificação de RNA
Tamponado com Fosfato Salino	Fisher Scientific	50146771
75 cm Canted Neck Cell Culture Flask	Corning	430641U
6 poços Non-Pyrogenic Cell Culture Plate	Corning	3506
Pipet Controller Ultra	Corning	4099
Photoshop	Adobe	19.0.1.334
25 cm Canted Neck Cell Culture Flask	Corning	7200876
Triton X-100	Sigma	X100-1L
15 mL cônico polipropileno Falcon tubo	Corning	352099
Seringa de 10 mL		Capota de
1300 Série A2	Thermo Scientific	1377
accuspin Centrífuga Micro17	Fisher Scientific	13100675
7500 Fast sistema de PCR em tempo real	Applied Biosystems	3052632
EVOS FL Microscópio de imunofluorescência	Life Technologies	01414-155G-291
Leica Microscópio de luz invertida	Leica	DMi1
Illrustrator	Adobe	22.0.1.253
Planilhas Excel	Microsoft	2016
Deckglaser 18 mm óculos de cobertura	NeuVitro	GG-18
Reichert Hemacitômetro de Linha Brilhante	Sigma	Z359629-1EA
2-mercaptoetanol	Fisher Bioreagentes	BP176-100	Para tampão de lise de RNA
1.2mL Frasco de Polipropileno Criogênico com Rosca Externa	Corning	430658	Para congelar células HESC
Dimetilsulfóxido (DMSO)	Sigma	D2650-100mL	para meios de congelamento

de transcrição reversa de cDNA de alta capacidade 4304437 Controle interno de colagenase de do reagente sanguíneo Segurança Biológica BD 302995