Enriquecimiento y caracterización de los microambientes Tumor inmunes y no inmunes en tumores murinos subcutáneos establecidos
Summary
Aquí se describe un método para separar y enriquecer los componentes del microambiente tumoral inmune y no inmune en tumores subcutáneos establecidos. Esta técnica permite el análisis separado de infiltrado inmune tumor y fracciones de tumor no inmune que pueden permitir una caracterización completa del microambiente tumoral inmune.
Abstract
El microambiente inmunológico del tumor (tiempo) se ha reconocido recientemente como un mediador crítico de la respuesta al tratamiento en tumores sólidos, especialmente para las inmunoterapias. Últimos avances clínicos en inmunoterapia destacan la necesidad de métodos reproducibles con precisión y completamente caracterizar el tumor y su infiltrado inmune asociada. Digestión enzimática del tumor y análisis cytometric del flujo permiten amplia caracterización de varios subconjuntos de células inmunitarias y fenotipos; sin embargo, profundidad del análisis a menudo está limitada por restricciones de fluoróforo en diseño del panel y la necesidad de adquirir muestras de tumor grande observar raras poblaciones inmunes de interés. Así, hemos desarrollado un método eficaz y alto rendimiento de separación y de enriquecer el infiltrado inmune del tumor de los componentes del tumor no inmunes. La digestión de tumor descrito y separación centrífuga de densidad permite caracterización independiente de tumor y el tumor fracciones infiltrado inmune y preserva la viabilidad celular y por lo tanto, proporciona una amplia caracterización del tumor estado inmunológico. Este método fue utilizado para caracterizar la heterogeneidad inmune espacial amplia en tumores sólidos, que demuestra la necesidad de técnicas perfiles inmunológicos tumor entero coherente. En general, este método proporciona una técnica eficaz y adaptable para la caracterización inmunológica de tumores murinos sólidos subcutáneos; como tal, esta herramienta puede utilizarse para caracterizar mejor las características inmunológicas tumorales y en la evaluación preclínica de nuevos estrategias de inmunoterapia.
Introduction
El momento represivo ha sido recientemente reconocido como un sello distintivo del cáncer y se sabe que juega un papel importante en el desarrollo, progresión y protección de los cánceres de tumor sólido así como reducir su susceptibilidad a la inmunoterapia1. El tiempo se compone de numerosos subconjuntos celulares y fenotipos, que proporcionan una visión crítica del estado inmunológico del tumor. Estos subconjuntos inmunológicos pueden ser estratificados más en células de origen mieloide, o linfocitos que juntos constituyen la mayoría de las respuestas inmunitarias innata y adaptativa2,3. Los avances recientes en el campo de la inmunoterapia de cáncer han demostrado que estrategias de inmunoterapia (es decir, los inhibidores de control inmune, receptor del antígeno quimérico de las células T, etc.) tienen el potencial para inducir cáncer durable regresiones; sin embargo, siguen siendo relativamente ineficaz en cánceres de tumor sólido4,5. Numerosos grupos han mostrado el obstáculo fundamental que puede jugar en el tiempo en tratamiento éxito6,7, y por lo tanto, existe una necesidad de evaluar con precisión nuevas inmunoterapias en el ajuste pre-clínico centrándose específicamente en su capacidad de modular o superar el tiempo8.
Los esfuerzos actuales para caracterizar el tiempo típicamente utilizan cualquiera microscopia o fluyen cytometry junto con anticuerpo etiquetado estrategias para identificar subconjuntos celulares inmunes y sus características9,10. Estas dos estrategias proporcionan únicamente información, como microscopía permite apreciación espacial de subconjuntos celulares y citometría de flujo proporciona alto rendimiento y cuantificación más amplio de los cambios celulares. A pesar de las mejoras recientes en inmunohistoquímica multiplex fluorescente optimizando los sistemas de proyección de imagen espectrales, que ahora pueden soportar hasta 7 parámetros, tamaño del panel limitado dificulta amplio nivel inmune perfiles y por lo tanto esta técnica es a menudo reservado para más centrado el análisis. Como resultado, citometría de flujo sigue siendo uno de inmune más utilizada técnicas de perfiles. A pesar de su uso generalizado en la caracterización del tiempo, los métodos utilizados para el procesamiento y coloración son muy variable. Más a menudo los protocolos utilizan un tumor disociación enzimática (es decir, colagenasas, ADNasa, etc.) y métodos de disociación manual para lograr suspensiones unicelular, seguida de anticuerpos de tinción y análisis7. A pesar de las ventajas de cada método, numerosos grupos han demostrado la amplia variabilidad que puede ser inducida a través de estas técnicas11. Esto hace comparaciones Cruz-estudio de perfiles de microambiente del tumor extremadamente difícil, incluso al evaluar el mismo modelo tumoral murino. Además, estos métodos proporcionan un potencial limitado para evaluar tumor celular e inmune tumor infiltra componentes independientemente, puesto que ambos componentes se entremezclan después de la digestión. Entonces límites de cantidad de muestra varios paneles de tinción y análisis, que se convierte en un problema de importancia cuando se intenta caracterizar subconjuntos inmunológicos raros (tumor-específicas, es decir, las células T)12. Técnicas más recientes como la citometría de masas o citometría por tiempo de vuelo (CyTOF), permiten análisis fenotípico multidimensional de subconjuntos celulares con algunos sistemas de apoyo a diseños de panel de más de 42 parámetros independientes13. A pesar del tremendo poder de CyTOF tecnología en perfiles inmune, sigue siendo limitada debido a los gastos, conocimientos de análisis y el acceso al equipo. Además, muchos protocolos CyTOF recomiendan purificación de inmunes subconjuntos para mejorar cocientes signal-to-noise14, y por lo tanto sugerimos que se podría utilizar nuestro método de enriquecimiento de CyTOF análisis para mejorar la calidad de los datos.
Adjunto describimos un análisis método que incorpora a inmune tumor infiltra la separación y digestión de microambiente del tumor. El propósito de este método es permitir perfiles de alto rendimiento independiente del infiltrado inmune tumor y fracciones celulares de tumor para una caracterización más amplia del microambiente tumoral. Usando este método, más demostramos la importancia de realizar análisis de todo tumor, como un modelo de tumor sólido subcutáneo fue encontrado para tener heterogeneidad inmunológica espacial significativa. En general, este método puede más exactamente y constantemente comparar entre muestras porque se enriquece en un subgrupo celular inmune dentro del tumor y permite perfiles independientes de la célula tumoral y fracciones inmunes de un tumor.
Protocol
Representative Results
Discussion
El tiempo se compone de moléculas y componentes celulares diversos y complejos. La evidencia reciente sugiere que una caracterización precisa de este entorno puede proporcionar una mejor comprensión del tratamiento de éxito o fracaso y puede incluso ayudar a identificar mecanismos de resistencia terapéutica. Por ejemplo, aumentando los niveles de intratumoral de varias células inmunosupresoras (es decir, MDSCs, células de T reguladoras, etc.) puede atenuar la respuesta inmune efectora y derogar e…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
JMN reconoce apoyo financiero del Institute of General Medical Sciences (T32GM088129) y el Instituto Nacional de odontología e investigación craneofacial (F31DE026682) de los institutos nacionales de salud. El contenido es responsabilidad exclusiva de los autores y no representan necesariamente las opiniones oficiales de los institutos nacionales de salud. Este proyecto fue apoyado también por la citometría y la base de clasificación de la célula en el Baylor College of Medicine con la financiación de los NIH (P30 AI036211 CA125123 P30 y S10 RR024574) y la asistencia de expertos de Joel M. Sederstrom.
Materials
| 6 to 12 week old male C57BL/6 mice | Jackson Laboratory | N/A | Mice used in our tumor studies |
| MEER Murine Syngeneic Cancer Cell line | Acquired from collaborator | N/A | E6/E7 HPV antigen expressing murine tonsillar epithelial cancer cell line |
| 70% isopropyl alcohol | EMD Milipore | PX1840 | |
| Murine surgical tool kit | World Precision Instruments | MOUSEKIT | Primarily only need scissors, tweezers, and a scalpel. |
| 24-well plate | Denville Scientific Inc. | T1024 | Or any 24-well flat bottom plate. |
| RPMI-1640 media | Sigma-Aldrich | R0883 | |
| Collagenase I | EMD Milipore | 234153 | |
| Collagenase IV | Worthington Biochemical Corporation | LS004189 | |
| DNase I | Sigma-Aldrich | 11284932001 | |
| Low Speed Orbital Shaker | BioExpress (supplier: Genemate) | S-3200-LS | Or any orbital shaker. |
| Thermoregulating incubator | Fisher Scientific | 13-255-27 | Or any other thermo-regulated incubator |
| FBS | Sigma-Aldrich | F8192 | |
| EDTA | AMRESCO | E177 | |
| 1 mL Pipette and tips | Eppendorf | 13-690-032 | Or any other pipette and tips |
| 40 um Cell Strainers | Fisher Scientific | 22363547 | |
| 50 mL Centrifuge Tubes | Denville Scientific Inc. | C1062-P | |
| 15 mL Conical Tubes | Denville Scientific Inc. | C1012 | |
| 10 mL Luer-Lok Syringe without needles | BD | 309604 | |
| Lymphoprep Density Gradient Medium | STEMCELL Technologies | 7811 | |
| Transfer Pipettes | Denville Scientific Inc. | P7212 | |
| 96-well U-bottom plates | Denville Scientific Inc. | ||
| DPBS | Sigma Aldrich | D8573 | |
| FoxP3 Transcription Factor Staining Buffer Set | ThermoFisher Scientific | 00-5523-00 | Fix/Permeabilization Buffer and Permeabilization Buffer |
| Thermoregulated Centrifuge | Eppendorf | 5810 R | |
| Attune NxT Flow Cytometer | ThermoFisher Scientific | N/A | For 96-well cell volumetric counting |
| Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block) Clone 2.4G2 | ThermoFisher Scientific | 553141 | Fc Block |
| LIVE/DEAD Fixable Blue Dead Cell Stain Kit, for UV excitation | ThermoFisher Scientific | L34962 | Fixable viability stain |
| CD45 Monoclonal Antibody (30-F11), APC-eFluor 780 | ThermoFisher Scientific | 47-0451-80 | |
| TCR beta Monoclonal Antibody (H57-597), APC | ThermoFisher Scientific | 17-5961-82 | |
| CD8-α Antibody (KT15), PE | Santa Cruz Biotechnology | sc-53473 | |
| CD4 Monoclonal Antibody (GK1.5), PE-Cyanine5 | ThermoFisher Scientific | 15-0041-81 | |
| MHC Class II (I-A/I-E) Monoclonal Antibody (M5/114.15.2), Alexa Fluor 700 | ThermoFisher Scientific | 56-5321-82 | |
| CD11c Monoclonal Antibody (N418), PE-Cyanine5 | ThermoFisher Scientific | 15-0114-82 | |
| F4/80 Monoclonal Antibody (BM8), eFluor 450 | ThermoFisher Scientific | 48-4801-80 | |
| CD11b Monoclonal Antibody (M1/70), APC | ThermoFisher Scientific | 17-0112-81 | |
| Ly-6G (Gr-1) Monoclonal Antibody (RB6-8C5), PE | ThermoFisher Scientific | 12-5931-82 | |
| CD274 (PD-L1, B7-H1) Monoclonal Antibody (MIH5), PE-Cyanine7 | ThermoFisher Scientific | 25-5982-80 | |
| CD273 (B7-DC) Monoclonal Antibody (122), PerCP-eFluor 710 | ThermoFisher Scientific | 46-9972-82 | |
| Ki-67 Monoclonal Antibody (B56), BV711 | BD Biosciences | 563755 |
Referências
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