Enriquecimento e caracterização do microambiente que imune e não imune Tumor em tumores murino subcutâneos estabelecidas
Summary
Aqui nós descrevemos um método para separar e enriquecer os componentes do microambiente de imune e não imune a tumor em tumores subcutâneos estabelecidas. Esta técnica permite a análise separada de infiltrar imune tumor e frações não imune tumor que podem permitir a caracterização abrangente do microambiente imune do tumor.
Abstract
O microambiente imune tumor (tempo), recentemente, tem sido reconhecida como um mediador crítico da resposta do tratamento em tumores sólidos, especialmente para imunoterapias. Recentes avanços clínicos em imunoterapia destacam a necessidade de métodos pode ser reproduzidos com precisão e completamente caracterizar o tumor e seu associado infiltrado imune. Digestão enzimática do tumor e análise do fluxo cytometric permitam ampla caracterização dos vários subconjuntos de células imunes e fenótipos; no entanto, profundidade de análise muitas vezes é limitada pela fluoróforo restrições no projeto do painel e a necessidade de adquirir amostras de tumor grande observar raras populações imunes de interesse. Assim, nós desenvolvemos um método eficaz e alta taxa de transferência para separar e enriquecendo o infiltrado imune tumor dos componentes não imune tumor. A digestão de tumor descrito e separação centrífuga baseado em densidade técnica permite separada caracterização do tumor e tumor infiltrar imune fracções e preserva a viabilidade celular e assim, fornece uma ampla caracterização do tumor estado imunológico. Este método foi usado para caracterizar extensa espacial imune heterogeneidade em tumores sólidos, que demonstra ainda mais a necessidade de técnicas de perfil imunológica de tumor todo consistente. Em geral, esse método proporciona uma técnica eficaz e adaptável para a caracterização imunológica do subcutâneos tumores sólidos de murino; como tal, esta ferramenta pode ser usada para melhor caracterizar as características imunológicas tumorais e na avaliação pré-clínica de novas estratégias de imunoterapia.
Introduction
O tempo supressivo recentemente tem sido reconhecido como uma marca registrada de câncer e é conhecido por desempenhar um papel significativo no desenvolvimento e progressão, proteção de cânceres de tumor sólido, bem como atenuar sua susceptibilidade à imunoterapia1. O tempo é composto por vários subconjuntos celulares e fenótipos, os quais fornecem a introspecção crítica do estado imunológico do tumor. Estes subconjuntos imunológicos podem ser ainda mais estratificados em células de origem mieloide, ou linfócitos, que juntos constituem a maioria das respostas de imune inata e adaptativa2,3. Recentes avanços no campo da imunoterapia têm demonstrado que as estratégias de imunoterapia (i.e., inibidores da barreira imune, receptor de antígeno quimérico células-T, etc.) têm o potencial para induzir câncer durável regressões; no entanto, eles permanecem relativamente ineficazes em tumores sólidos cancros4,5. Numerosos grupos mostraram o obstáculo crítico que o tempo pode jogar no tratamento sucesso6,7, e ainda assim, há uma necessidade de avaliar com precisão novas imunoterapias no cenário pré-clínico enfocando especificamente seus capacidade de modular ou superar o tempo8.
Os esforços atuais para caracterizar o tempo normalmente utilizam ou microscopia ou fluem cytometry juntamente com anticorpo rotulagem estratégias para identificar subconjuntos de celulares imunes e suas características9,10. Estas duas estratégias fornecem informações excepcionalmente diferentes, como microscopia permite valorização espacial de subconjuntos de celulares e citometria de fluxo fornece alto rendimento e quantificação mais ampla de mudanças celulares. Apesar das recentes melhorias no multiplex fluorescente imuno-histoquímica otimizando sistemas de imagem espectrais, que agora podem suportar até 7 parâmetros, tamanho limitado do painel torna nível mais amplo imune de perfil difícil e, portanto, esta técnica é frequentemente reservados para mais focada análises. Como resultado, citometria de fluxo permanece um do mais amplamente utilizado imunológico técnicas de criação de perfil. Apesar de seu uso generalizado na caracterização do tempo, os métodos utilizados para processamento e coloração são bastante variável. Mais frequentemente protocolos utilizam um tumor dissociando enzima (ou seja, colagenases, DNase, etc.) e métodos de dissociação manual para atingir as suspensões de célula única, seguido por anticorpo manchando e análise7. Apesar dos benefícios de cada método, numerosos grupos mostraram a extensa variabilidade que pode ser induzida através destas técnicas11. Isto faz comparações de estudo transversal de tumor microambiente perfil extremamente difícil, mesmo quando avaliar o mesmo modelo de tumor murino. Além disso, esses métodos fornecem um potencial limitado para avaliar tumor celular e imunológico tumor infiltrar componentes independente, desde que ambos os componentes são intercalados após a digestão. Quantidade de amostra então limita multi-painel manchando e análise, que se torna um grande problema ao tentar caracterizar subconjuntos imunológicos raros (i.e., tumor-específicas células T)12. Técnicas mais recentes como citometria de massa ou citometria por hora de voo (CyTOF), permitem alta dimensão análise fenotípica de subconjuntos de celulares com alguns sistemas de apoio a projetos de painel superior a 42 parâmetros independente13. Apesar do enorme poder da CyTOF tecnologia em perfil imune, continua a ser limitada devido a despesa, conhecimentos de análise e o acesso ao equipamento. Além disso, muitos protocolos de CyTOF recomendam purificação de subconjuntos imunes para melhorar a relação sinal-ruído14, e, assim, sugerimos que o nosso método de enriquecimento poderia ser usado a montante da análise CyTOF para melhorar a qualidade dos dados.
Neste documento descrevemos uma digestão de microambiente do tumor e análise método que incorpora imune tumor infiltrar na separação. A finalidade desse método é permitir que independente da elevado-produção de perfil do infiltrado imune tumor e frações celulares do tumor para caracterização mais ampla do microambiente do tumor. Usando esse método, demonstramos ainda mais a importância da realização de análises de todo tumor, como um modelo de tumor sólido subcutânea foi encontrado para ter significativa heterogeneidade espacial de imunológica. Em geral, esse método pode com mais precisão e de forma consistente comparar entre amostras porque enriquece para subconjuntos celulares imunes dentro do tumor e permite a caracterização independente das células do tumor e imunes frações de um tumor.
Protocol
Representative Results
Discussion
O tempo é composto de moléculas e componentes celulares diversos e complexos. Recentes sugerem que a caracterização exata deste ambiente pode fornecer um melhor entendimento do tratamento de sucesso ou fracasso e pode até mesmo ajudar a identificar os mecanismos de resistência terapêutica. Por exemplo, aumentando os níveis de intratumoral de várias células imunossupressoras (i.e., MDSCs, pilhas de T reguladoras, etc.) pode atenuar efetoras imune respostas e abrogar efeitos imunoterapia. Por ou…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
JMN reconhece o apoio financeiro do Instituto Nacional de General Medical Ciências (T32GM088129) e do Instituto Nacional de Dental & Craniofacial Research (F31DE026682) ambos os institutos nacionais de saúde. O conteúdo é exclusivamente da responsabilidade dos autores e não representa necessariamente a opinião oficial do institutos nacionais da saúde. Este projeto também foi apoiado pela citometria e núcleo de classificação de célula no Baylor College of Medicine com financiamento do NIH (P30 AI036211, P30 CA125123 e S10 RR024574) e a assistência especializada de Joel M. Sederstrom.
Materials
| 6 to 12 week old male C57BL/6 mice | Jackson Laboratory | N/A | Mice used in our tumor studies |
| MEER Murine Syngeneic Cancer Cell line | Acquired from collaborator | N/A | E6/E7 HPV antigen expressing murine tonsillar epithelial cancer cell line |
| 70% isopropyl alcohol | EMD Milipore | PX1840 | |
| Murine surgical tool kit | World Precision Instruments | MOUSEKIT | Primarily only need scissors, tweezers, and a scalpel. |
| 24-well plate | Denville Scientific Inc. | T1024 | Or any 24-well flat bottom plate. |
| RPMI-1640 media | Sigma-Aldrich | R0883 | |
| Collagenase I | EMD Milipore | 234153 | |
| Collagenase IV | Worthington Biochemical Corporation | LS004189 | |
| DNase I | Sigma-Aldrich | 11284932001 | |
| Low Speed Orbital Shaker | BioExpress (supplier: Genemate) | S-3200-LS | Or any orbital shaker. |
| Thermoregulating incubator | Fisher Scientific | 13-255-27 | Or any other thermo-regulated incubator |
| FBS | Sigma-Aldrich | F8192 | |
| EDTA | AMRESCO | E177 | |
| 1 mL Pipette and tips | Eppendorf | 13-690-032 | Or any other pipette and tips |
| 40 um Cell Strainers | Fisher Scientific | 22363547 | |
| 50 mL Centrifuge Tubes | Denville Scientific Inc. | C1062-P | |
| 15 mL Conical Tubes | Denville Scientific Inc. | C1012 | |
| 10 mL Luer-Lok Syringe without needles | BD | 309604 | |
| Lymphoprep Density Gradient Medium | STEMCELL Technologies | 7811 | |
| Transfer Pipettes | Denville Scientific Inc. | P7212 | |
| 96-well U-bottom plates | Denville Scientific Inc. | ||
| DPBS | Sigma Aldrich | D8573 | |
| FoxP3 Transcription Factor Staining Buffer Set | ThermoFisher Scientific | 00-5523-00 | Fix/Permeabilization Buffer and Permeabilization Buffer |
| Thermoregulated Centrifuge | Eppendorf | 5810 R | |
| Attune NxT Flow Cytometer | ThermoFisher Scientific | N/A | For 96-well cell volumetric counting |
| Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block) Clone 2.4G2 | ThermoFisher Scientific | 553141 | Fc Block |
| LIVE/DEAD Fixable Blue Dead Cell Stain Kit, for UV excitation | ThermoFisher Scientific | L34962 | Fixable viability stain |
| CD45 Monoclonal Antibody (30-F11), APC-eFluor 780 | ThermoFisher Scientific | 47-0451-80 | |
| TCR beta Monoclonal Antibody (H57-597), APC | ThermoFisher Scientific | 17-5961-82 | |
| CD8-α Antibody (KT15), PE | Santa Cruz Biotechnology | sc-53473 | |
| CD4 Monoclonal Antibody (GK1.5), PE-Cyanine5 | ThermoFisher Scientific | 15-0041-81 | |
| MHC Class II (I-A/I-E) Monoclonal Antibody (M5/114.15.2), Alexa Fluor 700 | ThermoFisher Scientific | 56-5321-82 | |
| CD11c Monoclonal Antibody (N418), PE-Cyanine5 | ThermoFisher Scientific | 15-0114-82 | |
| F4/80 Monoclonal Antibody (BM8), eFluor 450 | ThermoFisher Scientific | 48-4801-80 | |
| CD11b Monoclonal Antibody (M1/70), APC | ThermoFisher Scientific | 17-0112-81 | |
| Ly-6G (Gr-1) Monoclonal Antibody (RB6-8C5), PE | ThermoFisher Scientific | 12-5931-82 | |
| CD274 (PD-L1, B7-H1) Monoclonal Antibody (MIH5), PE-Cyanine7 | ThermoFisher Scientific | 25-5982-80 | |
| CD273 (B7-DC) Monoclonal Antibody (122), PerCP-eFluor 710 | ThermoFisher Scientific | 46-9972-82 | |
| Ki-67 Monoclonal Antibody (B56), BV711 | BD Biosciences | 563755 |
Referências
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