Summary

Generation der ersten Herz Bereich-wie kardiale Stammväter und ventrikuläre wie Herzzellen aus menschlicher pluripotenter Stammzellen

Published: June 19, 2018
doi:

Summary

Hier beschreiben wir eine skalierbare Methode mit einer einfachen Kombination von Activin A und Lentivirus-vermittelten Id1-Überexpression, erste Herz Bereich-wie kardiale Stammväter und ventrikuläre wie Herzzellen aus menschlichen pluripotenten Stammzellen zu generieren.

Abstract

Die Generation der große Mengen von funktionalen menschlicher pluripotenter Stammzellen gewonnen kardiale Stammväter und Herzzellen definierten Herz Bereich Ursprungs ist eine wichtige Voraussetzung für kardiale Zelltherapien und Krankheit Modellierung. Wir haben kürzlich gezeigt, dass Id Gene notwendig und ausreichend, um erste Herz Bereich Vorfahren während der vertebrate Entwicklung angeben. Diese Differenzierung-Protokoll nutzt diese Erkenntnisse und nutzt Id1 Überexpression in Kombination mit Activin A als potente Angabe Hinweise, um erste Herz Bereich-wie (FHF-L) Vorfahren zu produzieren. Wichtig ist, differenzieren resultierende Stammväter ventrikuläre wie Kardiomyozyten effizient (~ 70 – 90 %). Hier beschreiben wir eine detaillierte Methode, um (1) erzeugen Id1-überexprimierenden hPSCs und (2) skalierbare Mengen an cryopreservable FHF-L Stammväter und ventrikuläre wie Kardiomyozyten differenzieren.

Introduction

Produktion in großem Maßstab menschlicher pluripotenter Stammzellen (hPSCs)-abgeleitete kardialen Vorläuferzellen und Herzzellen ist eine wichtige Voraussetzung für stammzellbasierte Therapien1, Modellierung,2,3 und die schnelle Charakterisierung der Krankheit neuartige Wege zur Regulierung kardialen Differenzierung4,5,6 und Physiologie7,8. Obwohl eine Reihe von Studien9,10,11,12,13,14haben,15 zuvor beschriebenen hocheffiziente kardialen Differenzierung Protokolle von hPSCs, hat keiner den Herzen Feld Ursprung des daraus resultierenden Kardiomyozyten, trotz der Identifizierung von molekularen Unterschiede zwischen Links angesprochen (erste Herz-Feld) und rechts (zweites Herz-Feld) ventrikuläre Kardiomyozyten16 und die Existenz von Herzen feldspezifischen angeborene Herzerkrankungen; d. h. hypoplastischen Linksherz-Syndrom17 oder Arrhythmogenic rechtsventrikuläre Dysplasie18. So, die Generation der kardialen Vorläuferzellen und Herzzellen definierten Herz Feld Herkunft aus hPSCs werden immer eine Notwendigkeit, um ihre Relevanz als therapeutische zu erhöhen und Krankheiten Modellierungs-Tools.

Dieses Protokoll setzt auf die konstitutive Überexpression des Id1, ein neu identifizierte5 erste Herz Feld angeben Stichwort, das in Kombination mit Activin A, notwendig und ausreichend, um Cardiogenesis in hPSCs zu initiieren. Vor allem, Cunningham Et al. (2017) 5 zeigen, dass Id1-induzierte Stammväter speziell erste Herz-Feld (HCN4, TBX5) aber keine zweite Herz Feldmarken (SIX2, ISL1) Ausdrücken, wie sie kardialen Differenzierung zu unterziehen. Darüber hinaus zeigen die Autoren auch, dass transgene mausembryonen fehlt die ganze Id -Familie von Genen (Id14), zu entwickeln, ohne zu bilden erste Herz Bereich kardiale Stammväter, während mehr medialen und hinteren kardialen Vorläuferzellen ( zweites Herz-Feld) kann noch bilden, was darauf hindeutet, dass Id Proteine wichtig sind, erste Herz Feld Cardiogenesis in Vivozu initiieren. Bequem, Id1-induzierte Stammväter können kryokonserviert und spontan in Kardiomyozyten anzeigen ventrikuläre-ähnliche Merkmale, einschließlich der ventrikulären-spezifische Marker (IRX4, MYL2) Ausdruck zu unterscheiden und ventrikuläre wie Aktionspotentiale.

Hier beschreiben wir eine einfache und skalierbare Methode erste Herz Bereich-wie (FHF-L) kardiale Stammväter und ventrikuläre wie Herzzellen von Id1 überexprimierenden hPSCs zu erzeugen. Ein wichtiges Merkmal dieses Protokolls ist die Möglichkeit zur Erzeugung von kardialen Vorläuferzellen aus nachfolgenden Cardiomyocyte Produktion mit einer bequemen Kryokonservierung Schritt zu entkoppeln. Zusammenfassend lässt sich sagen dieses Protokoll beschreibt die notwendigen Schritte (1) generieren Id1-überexprimierenden hPSCs, (2) generieren FHF-L kardialen Vorläuferzellen aus hPSCs, (3) resultierende Stammväter Tiefgefrieren und (4) wieder aufnehmen FHF-L kardialen Vorläuferzellen Differenzierung und generieren hochangereichertes (> 70 – 90 %) gegen ventrikuläre wie Kardiomyozyten.

Protocol

(1) Id1 Virus Vorbereitung und Infektion Id1 überexprimierenden Lentivirus Co transfecting pCMVDR8.74, pMD2.G und pCDH-EF1-Id1-PGK-PuroR zu generieren (Addgene: Plasmid #107735) in HEK293T Zellen. Viruspartikel zu sammeln, Filtrat aus der Überstand zu reinigen und lagern bei-80 ° C wie Kitamura Et al. (2003) 19. Alternativ produzieren Id1 Lentivirus kommerziell durch pCDH-EF1-Id1-PGK-PuroR an einen Lentivirus produzierenden Lieferanten senden.Achtung: Bitte folgen Sie Len…

Representative Results

Generation von hPSCs Id1 LinienhPSCs sind mit einem Lentivirus Vermittlung Id1 Überexpression (Abb. 1A) infiziert. Sobald hPSCId1 erzeugt werden, wird die Transgene Ausdruck durch qRT-PCR (Abbildung 1B) quantifiziert. Nur hPSCId1 Linien auszudrücken Id1 mRNA Ebene größer als 0,005 Falte des GA…

Discussion

Achten Sie für erfolgreiche Differenzierungen darauf, eng oben aufgelisteten Anweisungen folgen. Darüber hinaus stellen wir hier wichtige Parameter, die Differenzierung Ergebnisse stark beeinflussen. Bevor Sie beginnen eine Differenzierung, die folgenden drei morphologische Parameter beachtet werden: ein Stamm Morphologie der hPSCsId1, eine hohe Verdichtung der zellulären und eine hohe Confluence (> 90 %) der Kultur an Tag 0. In dieser Hinsicht optimale Differenzierung Bedingungen entstehen am besten durch …

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Wir danken Mitglieder des Colas Lab für hilfreiche Diskussionen und Kritiken des Manuskripts. Diese Studie wurde unterstützt durch NIH/NIEHS R44ES023521-02 und CIRM DISC2-10110 räumt Dr. Colas.

Materials

ACTC1 antibody Sigma A7811
Activin A Stem Cell Technologies Hu Recom Activin A
Antibiotic Antimycotic (Anti-Anti) Thermo Fisher Scientific 15240062
B27 supplement Thermo Fisher Scientific 17504044
B27 supplement w/o – insulin Thermo Fisher Scientific A1895601
B27 supplement w/o – vitamin A Thermo Fisher Scientific 12587001
CDH5 antibody R&D Systems AF938
CryoStor CS10 Stem Cell Technologies 7930 Cryopreservation reagent
DMEM high Glucose Mediatech 10-013-CV 
DPBS w/ Ca & Mg Corning 21-030-CV
EDTA Thermo Fisher Scientific 15575-038
FBS VWR 89510-186
FluoVolt membrane potential kit   Thermo Fisher Scientific F10488 For optical action potential acquisition, please refer to McKeithan et al. 2017
KnockOut Serum Replacement Gibco 10828010
Matrigel, Growth Factor Reduced Corning 356231 Coating reagent
mTeSR1 media kit Stem Cell Technologies 5850
PBS w/o Ca & Mg Corning 21-040-CV
Penicillin-Streptomycin Gibco
Puromycin  Acros 227422500
ReLeSR Stem Cell Technologies 5872 Enzyme-free dissociation reagent
RPMI 1640 Thermo Fisher Scientific 11875-093
TAGLN antibody Abcam ab14106
Thiazovivin Stem Cell Technologies 72254 RHO/ROCK pathway inhibitor
TrypLE Express Thermo Fisher Scientific 12605 -010 1X enzyme-containing dissociation reagent
Tyrodes solution mix packets   Sigma T2145-10X1L (For optical action potential acquisition, please refer to McKeithan et al. 2017)

Referências

  1. Chong, J. J., et al. Human embryonic-stem-cell-derived cardiomyocytes regenerate non-human primate hearts. Nature. 510, 273-277 (2014).
  2. Kodo, K., et al. iPSC-derived cardiomyocytes reveal abnormal TGF-beta signalling in left ventricular non-compaction cardiomyopathy. Nature cell biology. 18, 1031-1042 (2016).
  3. Kim, C., et al. Studying arrhythmogenic right ventricular dysplasia with patient-specific iPSCs. Nature. 494, 105-110 (2013).
  4. Colas, A. R., et al. Whole-genome microRNA screening identifies let-7 and mir-18 as regulators of germ layer formation during early embryogenesis. Genes & development. 26, 2567-2579 (2012).
  5. Cunningham, T. J., et al. Id genes are essential for early heart formation. Genes & development. , (2017).
  6. McKeithan, W. L., Colas, A. R., Bushway, P. J., Ray, S., Mercola, M. Serum-free generation of multipotent mesoderm (Kdr+) progenitor cells in mouse embryonic stem cells for functional genomics screening. Current protocols in stem cell biology. , 13 (2012).
  7. McKeithan, W. L., et al. An automated platform for assessment of congenital and drug-induced arrhythmia with hipsc-derived cardiomyocytes. Frontiers in physiology. 8, 766 (2017).
  8. Sharma, A., et al. High-throughput screening of tyrosine kinase inhibitor cardiotoxicity with human induced pluripotent stem cells. Science translational medicine. 9, (2017).
  9. Burridge, P. W., et al. Chemically defined generation of human cardiomyocytes. Nature methods. 11, 855-860 (2014).
  10. Kattman, S. J., et al. Stage-specific optimization of activin/nodal and BMP signaling promotes cardiac differentiation of mouse and human pluripotent stem cell lines. Cell stem cell. 8, 228-240 (2011).
  11. Laflamme, M. A., et al. Cardiomyocytes derived from human embryonic stem cells in pro-survival factors enhance function of infarcted rat hearts. Nature biotechnology. 25, 1015-1024 (2007).
  12. Lian, X., et al. Robust cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells via temporal modulation of canonical Wnt signaling. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, 1848-1857 (2012).
  13. Willems, E., et al. Small molecule-mediated TGF-beta type II receptor degradation promotes cardiomyogenesis in embryonic stem cells. Cell stem cell. 11, 242-252 (2012).
  14. Yang, L., et al. Human cardiovascular progenitor cells develop from a KDR+ embryonic-stem-cell-derived population. Nature. 453, 524-528 (2008).
  15. Palpant, N. J., et al. Generating high-purity cardiac and endothelial derivatives from patterned mesoderm using human pluripotent stem cells. Nature protocols. 12, 15-31 (2017).
  16. DeLaughter, D. M., et al. Single-cell resolution of temporal gene expression during heart development. Developmental cell. 39, 480-490 (2016).
  17. Liu, X., et al. The complex genetics of hypoplastic left heart syndrome. Nature genetics. 49, 1152-1159 (2017).
  18. Corrado, D., Link, M. S., Calkins, H. Arrhythmogenic right ventricular cardiomyopathy. New England journal of medicine. 376, 1489-1490 (2017).
  19. Kitamura, T., et al. Retrovirus-mediated gene transfer and expression cloning: powerful tools in functional genomics. Experimental hematology. 31, 1007-1014 (2003).

Play Video

Citar este artigo
Yu, M. S., Spiering, S., Colas, A. R. Generation of First Heart Field-like Cardiac Progenitors and Ventricular-like Cardiomyocytes from Human Pluripotent Stem Cells. J. Vis. Exp. (136), e57688, doi:10.3791/57688 (2018).

View Video