Microscopie multicolore localisation des protéines de la Membrane unique dans les organites des cellules mammifères vivants
Summary
Nous présentons ici un protocole pour la localisation multi-couleur des protéines membranaires unique dans les organites des cellules vivantes. Pour fixer les fluorophores, étiquetage des protéines sont utilisées. Protéines, situés dans des compartiments de différentes membranes de l’organite même, peuvent être localisées avec une précision d’environ 18 nm.
Abstract
Connaissance de la localisation des protéines cellulaires sous-compartiments est crucial de comprendre leur fonction spécifique. Nous présentons ici une technique de Super-résolution qui permet pour la détermination de la microcompartments qui sont accessibles pour les protéines en générant la localisation et le suivi des cartes de ces protéines. En outre, par microscopie de localisation multi-color, la localisation et le suivi des profils des protéines dans différents sous-compartiments sont obtenus simultanément. La technique est spécifique pour les cellules vivantes et est basée sur l’imagerie répétitive des protéines membranaires mobile unique. Protéines d’intérêt sont génétiquement fusionnées avec des tags auto étiquetage spécifiques, ce que l’on appelle. Ces balises sont des enzymes qui réagissent avec un substrat de manière covalente. Conjugué à ces substrats sont des colorants fluorescents. Réaction des protéines enzymatiques-tag avec la fluorescence étiqueté résultats de substrats en protéines marquées. Ici, tétraméthylrhodamine (TMR) et silicium Rhodamine (SiR) sont utilisés comme colorants fluorescents attachés aux substrats des enzymes. En utilisant des concentrations de substrat dans la MP à éventail nM, Sub stoechiométrique d’étiquetage est réalisé qui se traduit par des signaux distincts. Ces signaux est localisés avec ~ 15 – 27 précision nm. La technique permet d’imagerie multicolore de molécules simples, auquel cas le nombre de couleurs est limité par les colorants disponibles membrane perméable et le répertoire de l’étiquetage automatique des enzymes. Nous montrer la faisabilité de la technique de déterminer la localisation de l’enzyme de contrôle de la qualité (Pten)-induite par la kinase 1 (PINK1) dans différents compartiments mitochondriales au cours de son traitement par rapport à d’autres protéines de la membrane. Le critère de véritables interactions physiques entre les protéines simples différemment étiquetées par seule molécule frette ou suivi Co est limité, cependant, parce que les degrés d’étiquetage faibles réduisent la probabilité d’avoir deux protéines adjacentes marquées en même temps. Alors que la technique est forte pour l’imagerie des protéines dans les compartiments de la membrane, dans la plupart des cas il n’est pas appropriée pour déterminer la localisation des protéines solubles très mobiles.
Introduction
Le but du présent protocole est de fournir une méthode d’imagerie pour localiser et suivre les protéines de la membrane unique à l’intérieur des cellules vivantes. Nous appelons cette méthode de suivi et de localisation microscopie (TALM)1,2. Comme la microscopie de Reconstruction optique stochastique (tempête)3 et la microscopie de Fluorescence Photoactivation localisation ((F) PALM)4,5, TALM est une technique de localisation unique axée sur la molécule de fluorescence. Toutefois, il est distinct de la manière que la mobilité des protéines de la membrane en combinaison avec l’imagerie répétitive du même étiqueté molécule à différentes positions révèle le microcompartiment qui est accessible pour la protéine mobile. En d’autres termes, les localisations possibles de la protéine sont définies par l’architecture de l’organite et par la mobilité de la protéine1. La méthode est complémentaire à divers autres super-résolution techniques6,7,8 , parce qu’il révèle la localisation et la trajectoire des cartes par des protéines d’imagerie mobiles. L’étiquetage est basé sur l’utilisation des protéines de fusion génétiquement modifiées qui sont en soi non fluorescent. Ces protéines de fusion sont étiquetage automatique d’enzymes qui réagissent de façon covalente avec un substrat conjugué à un colorant. Cette procédure a l’avantage que le degré d’étiquetage peut être contrôlées par la quantité de substrat ajouté. En outre, il permet de varier la couleur de la fluorescence, selon le colorant choisi conjugué. Plusieurs étiquettes enzyme étiquetage automatique sont disponibles9. Un autre avantage d’utiliser l’étiquetage automatique des balises enzyme est, que les colorants conjugués sont généralement plus stable et plus brillante que protéines fluorescentes1 et protéines individuelles par conséquent peuvent être enregistrés plus et plus précisément jusqu’à ce qu’ils sont blanchis. Cela permet l’enregistrement des trajectoires des protéines mobiles et l’extraction des coefficients de diffusion10,11.
Ici, nous avons démontré la faisabilité de TALM avec des protéines de la membrane mitochondriale, mais il peut aussi être appliqué aux autres protéines de la membrane intra – et extra-cellulaires, y compris les cellules différents types12,13. Nous montrons que multi-couleur TALM plus permet la distinction simultanée des protéines dans différents sous-compartiments en complémentation existants Super-résolution fluorescence microscopy techniques14,15, 16. TALM est compatible avec17d’imagerie de cellules vivantes. La photo-physique des rhodamines choisis tétraméthylrhodamine (TMR) et silicium-Rhodamien (SiR), en particulier leur luminosité et leur stabilité, permet aux protéines de la membrane unique record sur plusieurs périodes de fourniture de cartes de localisation (et trajectoire). Cependant, TALM est limitée pour la localisation des protéines solubles avec les coefficients de diffusion élevée car le flou est trop élevé et les photons recueillis par image sont trop faibles pour la localisation correcte. En outre, TALM nécessite moins d’énergie que par exemple tempête ou émission de stimulé l’appauvrissement (STED) microscopie6,7, excitation réduisant effets phototoxiques. C’est important, car le stress phototoxique affecte souvent morphologie organellar18 et, partant, mobilité analyse19. En somme, nous présentons TALM multicolore dans les cellules vivantes comme une technique qui comble une lacune entre les méthodes de microscopie de localisation STORM/STED/PALM (F) et les techniques qui analysent la mobilité des protéines telles que la récupération de fluorescence après photoblanchiment (FRAP)20 ,21, corrélation de fluorescence spectroscopy (FCS)22et fluorescence croisent corrélation spectroscopie (SCCC)11,23.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ici, une technique pour la localisation seule molécule bicolore des protéines membranaires mobile a été présentée. Suivant le protocole, les protéines membranaires sont fondues à étiquetage automatique des protéines qui réagissent avec les colorants rhodamine TMR et SiR conjugué à leurs substrats respectifs. Rhodamine dyes sont lumineuse et photostable et permettent ainsi répétitifs d’imagerie1. Pour une performance réussie, plusieurs conditions et des sujets critiques doivent ga…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs aimeraient remercier le groupe de biophysique et Jacob Piehler à l’Université d’Osnabrück pour un soutien continu, Wladislaw Kohl pour assistance technique et la préparation du matériel et le Conseil de CellNanOs pour fournir des microscopes pour utilisation. Le projet a été financé par la 944 SFB.
Materials
| (2-(4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazinyl)-ethanesulfonic acid, 1 M) (HEPES) | Biochrom | #1104E | |
| DC1: Dichroid beam splitter | Chroma | 640 dcxr | NC506031 |
| DC2: Polychroic Mirror, beamsplitter | Chroma | zt405/488/561/640rpc | discontinued |
| Dulbecco´s Phosphate-Buffered Saline (PBS) 1x (w/o Ca & Mg) | Sigma-Aldrich & Co. | #RNBF8311 | |
| Earle´s MEM without phenol red, without L-Glutamine and without NaHCO3 containing 1% FBS, 0.1% HEPES, 0.1% NEAA, 0.1% Alanyl-L-Glutamine and 34.78% sodium hydrogen carbonate (NaHCO3 0.75g/l) | Imaging medium | ||
| Earle´s minimum essential medium (MEM) with phenol red, containing 1% Fetal Bovine Serum Superior (FBS), 0.1% HEPES (2-(4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazinyl)-ethanesulfonic acid, 1 M), and 0.1% non-essential amino acids (NEAA) | Growth medium | ||
| EF: Emission filter quadbandpass | AHF analysentechnik | F72-866 | Brightline HC 446 nm/523 nm/600 nm/677 nm |
| EMCCD camera | Andor | Andor iXON 897 | EMCCD camera |
| Emission filter QuadView filter cubes, orange | AHF analysentechnik | F39-637 | bandpass 582 – 619 nm |
| Emission filter QuadView filter cubes, red | Chroma | bandpass 655 – 725 nm (HQ 690/70) | |
| FBS (Fetal bovine serum) superior | Biochrom | S0615 | |
| Fluorescent beads: TetraSpeck™ Microspheres, 0.1 µm, fluorescent blue/green/orange/dark red | Thermo Fisher Scientific | T7279 | fluorescent microspheres |
| Glutamine | Biochrom | #0951C | |
| HeLa cells | DSMZ | ACC-57 | Cervical carcinoma cells from patient Henrietta Lacks |
| Hela cells CI::paGFP, stable | Muster et al., PLOSOne 2010 | ||
| Hela cells CV g::Halo7-Tag, stable | Appelhans et al., NanoLett 2012 | ||
| Hela cells Tom20::Halo7-Tag, stable | Appelhans et al., NanoLett 2012 | ||
| Image splitter | Photometrics | Dual-View QV2 | image splitter emission |
| Imaging processing software | ImageJ2 / Fiji | freeware | |
| Immersion Oil – ImmersolTM 518 F (ne = 1.518, ve = 45) | Carl Zeiss Jena GmbH | 444960-0000-000 | |
| Inverted epifluorescence microscope | Olympus IX-71/73/83 | ||
| Laser 561 nm, 200 mW | CrystaLaser | CL-561-200 | 561 nm emission |
| Laser 642 nm, 140 mW | Omicron | Luxx-642-140 | 642 nm emission |
| MATLAB | MathWorks | version R2013a | |
| MEM with Earle's Balanced Salt Solution 2.2 g/L NaHCO3, stable glutamine w/o PR | Biochrom | FG-0385 | |
| MEM with Earle's Balanced Salt Solution with 2.2 g/L NaHCO3, stable glutamine, Phenolred | Biochrom | FG-0325 | |
| MitoTracker® Deep Red FM | Thermo Fisher Scientific | M22426 | dye |
| MitoTracker® Green FM | Thermo Fisher Scientific | M7514 | dye |
| Multi-mode-optical polarization maintaining monomode fiber | Pointsource/Qioptiq | KineFLEX | |
| NHS-PEG-MAL, Rapp Polymer | Rapp Polymere GmbH Tübingen | coverslip coating | |
| non-essential amino acids (NEAA) | Biochrom | #0802E | |
| PEG 800 (Polyethylene glycol) 10 % | Carl Roth GmbH | Art No. 0263.1 | coverslip coating |
| Penicillin/Streptomycin | Biochrom | #0122E | |
| Plasmid for PINK1-Halo7-Tag expression | Beinlich et al., ACS Chemical Biology 2015 | ||
| Poly-L-lysine (1.2 mg/ml) | Sigma-Aldrich & Co. | Cat. No.P9155 | coverslip coating |
| RGD Peptide (Ac-CGRGDS-COOH) | Coring System Diagnostix GmbH, Gernsheim | coverslip coating / Intergrin receptor motif | |
| Silicon Rhodamine linked to HaloTag®-Ligand (SiRHTL) | personal gift from Kai Johnson | dye | |
| Software analysis plugin | self-written C. P. Richter, Biophysik Osnabrück | SLIMFAST 16g | |
| Tetramethylrhodamine / SNAP-Cell® TMR-Star linked to SNAP-Ligand (TMRstar) | New England Biolab® | S9105S | dye |
| Tetramethylrhodamine linked to HaloTag®-Ligand (TMRHTL) | Promega | G8251 | dye |
| TIRF condensor | Olympus | Cell^TIRF MITICO System | TIRF condensor |
| TIRF microscope controlling software | Olympus cellSens 1.12 | ||
| TIRF objective | Olympus | 150x oil objective (N.A. 1.45; Olympus UAPO) | |
| Trypsin/EDTA 10x | Biochrom | #0266 | |
| Water H2O 99,5 % Rotipuran® Low organic | Carl Roth GmbH | Art. No. HN57.1 |
Referências
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