Aqui, apresentamos um protocolo para multi cor localização das proteínas de membrana única em organelas de células vivas. Para anexar fluorophores, auto rotulação de proteínas são utilizadas. Proteínas, localizadas em compartimentos diferentes membranas da organela a mesma, podem ser localizadas com precisão de ~ 18 nm.
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Artigo de método
Localização de cor multi microscopia de proteínas de membrana única em organelas de células de mamíferos vivas
Neste artigo
Resumo
Resumo
Conhecimento sobre a localização de proteínas no celulares subcompartments é crucial para entender a sua função específica. Aqui, apresentamos uma técnica de super-resolução que permite a determinação de microcompartments que são acessíveis para proteínas, gerando a localização e rastreamento mapas destas proteínas. Além disso, pela microscopia de localização de várias cores, perfis de proteínas em diferentes subcompartments de rastreamento e a localização são obtidas simultaneamente. A técnica é específica para as células vivas e baseia-se a imagem repetitiva de proteínas da membrana celular único. Proteínas de interesse são geneticamente fundidas com tags Self rotulagem específicas, so-called. Essas marcas são enzimas que reagem com um substrato de maneira covalente. Conjugados para estes substratos são corantes fluorescentes. Reação das proteínas com a enzima-tag com a fluorescência rotulado resultados de substratos em proteínas etiquetadas. Aqui, diversos (TMR) e silício rodamina (Sr) são utilizados como corantes fluorescentes anexados para os substratos das enzimas. Usando concentrações de substrato a pM a gama nM, rotulagem sub estequiométrica é alcançado que resulta em sinais distintos. Estes sinais são localizados com ~ 15 – 27 precisão nm. A técnica permite a imagem multi cor de moléculas simples, segundo o qual o número de cores é limitado pelas tinturas de membrana permeável disponíveis e o repertório de auto-rotulantes enzimas. Vamos mostrar a viabilidade da técnica, determinando a localização da enzima (Pten) controle de qualidade-induzida da quinase 1 (PINK1) em diferentes compartimentos mitocondriais durante seu processamento em relação a outras proteínas de membrana. O teste para o verdadeiros interações físicas entre as proteínas única diferente etiquetadas por molécula FRET ou rastreamento co é restrito, porém, porque os graus de rotulagem baixos diminuem a probabilidade de ter duas proteínas adjacentes rotuladas ao mesmo tempo. Enquanto a técnica é forte para a imagem latente proteínas nos compartimentos de membrana, na maioria dos casos não é apropriado determinar a localização de proteínas solúveis altamente móveis.
Introdução
O objetivo do presente protocolo é fornecer um método de imagem para localizar e acompanhar as proteínas de membrana única dentro de células vivas. Chamamos esse método de rastreamento e localização de microscopia (TALM)1,2. Como estocástico microscopia de reconstrução óptica (Tempestade)3 e microscopia de fluorescência Photoactivation localização (PALM (F))4,5, TALM é uma técnica de localização de fluorescência único baseado na molécula. No entanto, é distinta da forma que a mobilidade das proteínas de membrana em combinação co....
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Protocolo
O seguinte protocolo segue as diretrizes do Comitê de ética de pesquisa instituição local.
1. métodos
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Cultura celular
- Cultive células, por exemplo as células HeLa (carcinoma do colo do útero humano), em um frasco de cultura de célula T25 contendo 5 mL do meio de crescimento em 37 ° C e 5% de CO2.
Nota: Para a imagem latente, dividir as células em lamelas preparadas (consulte as etapas 1.3 e 1.4) e manter-se em média por imagens.
- Cultive células, por exemplo as células HeLa (carcinoma do colo do útero humano), em um frasco de cultura de célula T25 contendo 5 mL do meio de crescimento em 37 ° C e 5% de CO2.
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Transfecção celular
Nota: Utilize as linhas celulares que expressam estàvel as proteínas marcadas sempre que possível
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Resultados
Análise de imagem e colocalization multi cor pode ajudar a determinar a localização sub-organellar das proteínas. Temos demonstrado isso antes com a fosfatase citosólica e homólogo tensin, PINK1, que tem diferentes submitocondrial locais devido ao seu processamento por proteases mitocondrial17. PINK1 é um fator importante, garantindo a funcionalidade mitocondrial34,35. Para determinar que a localização de P.......
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Discussão
Aqui, uma técnica para localização de dupla cor única molécula de proteínas da membrana celular foi apresentada. Seguindo o protocolo, proteínas de membrana são fundidos para auto-rotulantes proteínas que reagem com as tinturas de rodamina TMR e senhor conjugada com seus respectivos substratos. Rodamina corantes são brilhante e fotoestável e assim permitir a imagem repetitiva1. Para o desempenho bem sucedido, vários tópicos críticos e condições devem ser mantidas em mente.
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Divulgações
Os autores não têm nada para divulgar.
Agradecimentos
Os autores gostaria de agradecer o grupo de Biofísica e Jacob Piehler na Universidade de Osnabrück, para suporte contínuo, Wladislaw Kohl para assistência técnica e preparação de material e diretoria CellNanOs para fornecimento de microscópios para uso. O projeto foi financiado pelo SFB 944.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| (2-(4-(2-hidroxietil)-1-piperazinil)-ácido etanossulfônico, 1 M) (HEPES) | Biochrom | #1104E | |
| DC1: Divisor de feixe dicroido | Chroma | 640 dcxr | NC506031 |
| DC2: Espelho Polichroic, divisor de feixe | Chroma | zt405/488/561/640rpc | descontinuado |
| Dulbecco´ s Solução salina tamponada com fosfato (PBS) 1x (sem Ca & Mg) | Sigma-Aldrich & Co. | ||
| Earle&agudo; s MEM sem vermelho de fenol, sem L-Glutamina e sem NaHCO3 contendo 1% de FBS, 0,1% de HEPES, 0,1% de NEAA, 0,1% de Alanil-L-Glutamina e 34,78% de hidrogenocarbonato de sódio (NaHCO3 0,75g/l) | Meio de imagem | ||
| Earle&agudo; s meio essencial mínimo (MEM) com vermelho de fenol, contendo 1% de soro fetal bovino superior (FBS), 0,1% de HEPES (ácido 2-(4-(2-hidroxietil)-1-piperazinil)-etanossulfônico, 1 M) e 0,1% de aminoácidos não essenciais (NEAA) | Meio de crescimento | ||
| EF: Filtro de emissão quadbandpass | AHF analysentechnik | F72-866 | Brightline HC 446 nm/523 nm/600 nm/677 nm |
| Câmera EMCCD | Andor Andor | iXON 897 | Câmera EMCCD |
| Filtro de emissão Cubos de filtro QuadView, laranja | AHF analysentechnik | F39-637 passa-banda | 582 - 619 nm |
| Filtro de emissão Cubos de filtro QuadView, vermelho | Passa-banda Chroma | 655 - 725 nm (HQ 690/70) | |
| FBS (Soro fetal bovino) superior | Biochrom | S0615 | |
| Contas fluorescentes: TetraSpeck™ Microesferas, 0,1 e micro; m, azul fluorescente/verde/laranja/vermelho escuro | Microesferas fluorescentes | Thermo Fisher Scientific | T7279 |
| Glutamina | Biochrom | #0951C | |
| células HeLa | DSMZ | ACC-57 | Células de carcinoma cervical da paciente Henrietta Lacks |
| Células Hela CI::p aGFP, estável | Muster et al., PLOSOne 2010 | ||
| Células Hela CV g::Halo7-Tag, estável | Appelhans et al., NanoLett 2012 | ||
| Células Hela Tom20::Halo7-Tag, estável | Appelhans et al., NanoLett 2012 | ||
| Divisor de imagem | Photometrics | Dual-View Emissão | de divisor de imagem |
| Software de processamento de imagem | ImageJ2 / Fiji | freeware | |
| Óleo de imersão - ImmersolTM 518 F (ne = 1.518, ve = 45) | Carl Zeiss Jena GmbH | 444960-0000-000 | |
| Microscópio de epifluorescência invertida | Olympus IX-71/73/83 | ||
| Laser 561 nm, 200 mW | CrystaLaser | CL-561-200 | 561 nm |
| Laser 642 nm, 140 mW | Omicron | Luxx-642-140 | 642 nm emissão |
| MATLAB | MathWorks | versão R2013a | |
| MEM com Solução Salina Balanceada de Earle 2,2 g/L NaHCO3, glutamina estável sem PR | Biochrom | FG-0385 | |
| MEM com Solução Salar Balanceada de Earle com NaHCO3 2,2 g/L, glutamina estável, Fenolred | Biochrom | FG-0325 | |
| MitoTracker® Vermelho Escuro FM | Thermo Fisher Scientific | M22426 | corante |
| MitoTracker® Verde FM | Thermo Fisher Scientific | M7514 | corante Polarização |
| óptica multimodo mantendo fibra monomodo | Pointsource/Qioptiq | KineFLEX | |
| NHS-PEG-MAL, Rapp Polymer | Rapp Polymere GmbH Tü revestimento de | lamínula | |
| aminoácidos não essenciais (NEAA) | Biochrom | #0802E | |
| PEG 800 (Polietilenoglicol) 10 % | Carl Roth GmbH | Art No. 0263.1 | lamínula |
| Penicilina/Estreptomicina | Biochrom | #0122E | |
| Plasmídeo para expressão de PINK1-Halo7-Tag | Beinlich et al., ACS Chemical Biology 2015 | ||
| Poli-L-lisina (1,2 mg/ml) | Sigma-Aldrich & Co. | gato. No.P9155 | revestimento de lamínula |
| Peptídeo RGD (Ac-CGRGDS-COOH) | Sistema de Perfuração Diagnostix GmbH, | / motivo do receptor Intergrin | |
| Silício Rodamina ligada ao HaloTag®-Ligante (SiRHTL) | presente pessoal de Kai Johnson | corante | |
| Plugin de análise de software | auto-escrito C. P. Richter, Biophysik Osnabrü ck | SLIMFAST 16g | |
| Tetrametilrodamina / SNAP-Cell® TMR-Star ligado ao SNAP-Ligand (TMRstar) | Biolaboratório da Nova Inglaterra® | Corante S9105S | |
| Tetrametilrodamina ligada ao HaloTag®-Ligante (TMRHTL) | Promega | G8251 | corante |
| TIRF condensador | Olympus | Cell^TIRF MITICO System | TIRF condensador |
| TIRF microscópio software de controle | Olympus cellSens 1.12 | ||
| TIRF objetiva | Olympus | 150x objetiva de óleo (N.A. 1.45; Olympus UAPO) | |
| Tripsina/EDTA 10x | Biochrom | #0266 | |
| Água H2O 99,5 % Rotipuran® Baixo teor de orgânicos | Carl Roth GmbH | Art. Não. HN57.1 |
Referências
- Appelhans, T., Richter, C., Wilkens, V., Hess, S., Piehler, J., Busch, K. Nanoscale organization of mitochondrial microcompartments revealed by combining tracking and localization microscopy. Nano Letters. 12 (2), 610-616 (2012).
- Appelhans, T., Busch, K.
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Reimpressões e permissões
