単一の膜タンパク質生きた哺乳類細胞の細胞内小器官のマルチカラー ローカリゼーション顕微鏡
Summary
生きた細胞の細胞内小器官のマルチカラー単一膜蛋白質のローカリゼーションのためのプロトコルを紹介します。蛍光物質を添付、自己ラベリング タンパク質を使用します。~ 18 の精度と同じ細胞小器官の異なる膜コンパートメントに位置するタンパク質をローカライズできる nm。
Abstract
特定の機能を理解する細胞間のタンパク質の局在についての知識は欠かせません。ローカリゼーションを生成し、これらのタンパク質のマップを追跡によって蛋白質のためアクセスされる microcompartments の定量では、超解像技術を紹介します。また、マルチカラー ローカリゼーション顕微鏡による局在と別の間の蛋白質のプロファイルを追跡ができた。技術は生きているセルの特定、単一のモバイル膜タンパク質の反復的なイメージングに基づきます。興味の蛋白質遺伝子特定、いわゆる自主表示のタグが付いています。これらのタグは、共有結合に基質と反応する酵素です。蛍光染料は、これらの基板に活用されます。蛍光とタグ付きの酵素タンパク質の反応は、分類された蛋白質の基板結果をラベル付けします。ここでは、Tetramethylrhodamine (TMR) とシリコン ローダミン (SiR) は、酵素の基板に接続されている蛍光色素として使用されます。NM の範囲に午後の基質濃度を使用して、亜化学量論的ラベリングを実現、明確なシグナル。これらの信号は 〜 15-27 でローカライズされた nm 精度。テクニックが利用可能な膜透過性染料と酵素を自己ラベリングのレパートリーによって色の数を制限するという単一の分子のマルチカラー イメージングできます。品質管理酵素 (Pten) の局在を決定することにより技術の実現可能性を示す-他の膜タンパク質に関連して処理中に別のミトコンドリア コンパートメントにキナーゼ 1 (PINK1) を誘発します。1 分子 FRET または共同追跡によって異なるラベルの単一蛋白質の物理的な相互作用真のテストは、低ラベル度同時にラベルの付いた 2 つの隣接する蛋白質を持っていることの確率を減少するため、しかし制限です。テクニックは膜コンパートメントに蛋白質のイメージングのために強いが、ほとんどの場合じゃない機動性の高い水溶性タンパク質の局在を決定する適切です。
Introduction
このプロトコルの目標は、ローカライズし、生きた細胞内の単一の膜タンパク質を追跡するイメージング法を提供することです。このメソッドの追跡およびローカリゼーション顕微鏡 (TALM) の1,2と呼びます。確率光再建顕微鏡 (嵐)3など蛍光光局在顕微鏡 ((F) パーム)4、5TALM、単一分子蛍光ローカリゼーション手法です。ただし、同じ反復法を用いた膜タンパク質の組み合わせの移動はモバイルの蛋白質にアクセス microcompartment の明らかに異なる位置で分子をラベル方法で明瞭です。つまり、タンパク質の可能な限りのローカライズは、細胞小器官の構造、蛋白質1の移動に設定されています。メソッドは、ローカリゼーションおよび軌道イメージング モバイル蛋白質によってマップを明らかにするために様々 な他超解像技術6,7、8を補完するものです。ラベルは、それ自体非蛍光性は、遺伝子組み換えの融合蛋白質を使用してに基づいています。これらの融合蛋白質を染料に共役基板と反応して共有結合酵素自己ラベリングします。この手順ラベリング度ことができる利点があります追加基板の量によって制御されます。さらに、選択した共役系色素によって蛍光の色が変化することができます。自主表示タグ酵素がいくつかは、使用可能な9です。彼らは漂白まで正確に酵素タグを自己ラベリングは、共役系色素が通常より安定し、蛍光タンパク質1と個々 の蛋白質従って記録できるもはやより明るいなどを使用して別の利点。これにより、モバイルの蛋白質の軌跡の記録と拡散係数10,11の抽出。
ここでは、ミトコンドリア膜タンパク質と TALM の可能性を示すが、別のセル型12,13を含む、他の内極細胞膜タンパク質も適用できます。マルチカラー TALM さらに既存超解像蛍光顕微鏡技術14,15,に補完の別の間で蛋白質の同時の区別のためにことを示す16. ライブセル イメージング17と互換性のある TALM。光物理 Tetramethylrhodamine (TMR) とシリコン Rhodamien (SiR) の選ばれた rhodamines の特に明るさと安定性、そのすることができますレコードの単一膜タンパク質局在 (および軌道) のマップを提供する複数のフレームを。しかし、TALM は、モーション ブラーが高すぎると、フレームごと収集した光子が適切なローカライズの低すぎるので高拡散係数を持つ可溶性タンパク質の局在化のため制限されます。以外にも、TALM は、光毒性の影響を減らすよりも、たとえば嵐または誘導放出の枯渇 (STED) 顕微鏡6,7励振電力を必要とします。核形態18およびこうして移動解析19光毒性ストレスにしばしば影響を与えるので、これは重要です。合計では、ローカリゼーション顕微鏡方法嵐/STED の間のギャップを埋める手法として生きている細胞のマルチカラー TALM を提示 (F) パームと退色後蛍光回復など蛋白質の移動性を分析する手法 (FRAP)20/蛍光、蛍光相関分光法 (FCS)22, ,21クロス相関分光法 (FCCS)11,23。
Protocol
次のプロトコル ローカル施設研究倫理委員会のガイドラインに従います。 1. メソッド 細胞培養 たとえば HeLa 細胞 (ひと子宮頚部癌)、37 ° C、5% CO2で成長培地 5 mL を含むコート t25 フラスコ細胞培養用フラスコ、細胞を養います。注: 画像処理、(1.3 と 1.4 の手順を参照してください) 準備のカバーガラス上セルを分割および媒体をイ?…
Representative Results
マルチカラー イメージングと共局在解析は、タンパク質のサブ核の局在を決定する助けることができます。我々 は、ゾル性細胞質ホスファターゼと張力同族体、PINK1 ミトコンドリア プロテアーゼ17での処理のための別のサブ ミトコンドリア場所を持つ前にこれを示した。PINK1 ミトコンドリア機能34,35を保…
Discussion
ここでは、モバイルの膜タンパク質のデュアル カラー単一分子局在法が発表されました。次のプロトコル、膜タンパク質を自己分類 TMR と彼らのそれぞれの基板に共役サー ローダミン色素と反応する蛋白質に溶けます。ローダミンは染料は明るく、あるでき繰り返し画像1。成功したパフォーマンスのいくつかの条件や重要なトピックは、留意する必要があります。
<p cla…Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者は、生物物理学グループと継続的な支援、技術支援や、材料の準備のため Wladislaw コール用顕微鏡を提供する CellNanOs ボードにオスナブリュック大学でヤコブ Piehler に感謝したいと思います。SFB 944 によって資金が供給されたプロジェクト。
Materials
| (2-(4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazinyl)-ethanesulfonic acid, 1 M) (HEPES) | Biochrom | #1104E | |
| DC1: Dichroid beam splitter | Chroma | 640 dcxr | NC506031 |
| DC2: Polychroic Mirror, beamsplitter | Chroma | zt405/488/561/640rpc | discontinued |
| Dulbecco´s Phosphate-Buffered Saline (PBS) 1x (w/o Ca & Mg) | Sigma-Aldrich & Co. | #RNBF8311 | |
| Earle´s MEM without phenol red, without L-Glutamine and without NaHCO3 containing 1% FBS, 0.1% HEPES, 0.1% NEAA, 0.1% Alanyl-L-Glutamine and 34.78% sodium hydrogen carbonate (NaHCO3 0.75g/l) | Imaging medium | ||
| Earle´s minimum essential medium (MEM) with phenol red, containing 1% Fetal Bovine Serum Superior (FBS), 0.1% HEPES (2-(4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazinyl)-ethanesulfonic acid, 1 M), and 0.1% non-essential amino acids (NEAA) | Growth medium | ||
| EF: Emission filter quadbandpass | AHF analysentechnik | F72-866 | Brightline HC 446 nm/523 nm/600 nm/677 nm |
| EMCCD camera | Andor | Andor iXON 897 | EMCCD camera |
| Emission filter QuadView filter cubes, orange | AHF analysentechnik | F39-637 | bandpass 582 – 619 nm |
| Emission filter QuadView filter cubes, red | Chroma | bandpass 655 – 725 nm (HQ 690/70) | |
| FBS (Fetal bovine serum) superior | Biochrom | S0615 | |
| Fluorescent beads: TetraSpeck™ Microspheres, 0.1 µm, fluorescent blue/green/orange/dark red | Thermo Fisher Scientific | T7279 | fluorescent microspheres |
| Glutamine | Biochrom | #0951C | |
| HeLa cells | DSMZ | ACC-57 | Cervical carcinoma cells from patient Henrietta Lacks |
| Hela cells CI::paGFP, stable | Muster et al., PLOSOne 2010 | ||
| Hela cells CV g::Halo7-Tag, stable | Appelhans et al., NanoLett 2012 | ||
| Hela cells Tom20::Halo7-Tag, stable | Appelhans et al., NanoLett 2012 | ||
| Image splitter | Photometrics | Dual-View QV2 | image splitter emission |
| Imaging processing software | ImageJ2 / Fiji | freeware | |
| Immersion Oil – ImmersolTM 518 F (ne = 1.518, ve = 45) | Carl Zeiss Jena GmbH | 444960-0000-000 | |
| Inverted epifluorescence microscope | Olympus IX-71/73/83 | ||
| Laser 561 nm, 200 mW | CrystaLaser | CL-561-200 | 561 nm emission |
| Laser 642 nm, 140 mW | Omicron | Luxx-642-140 | 642 nm emission |
| MATLAB | MathWorks | version R2013a | |
| MEM with Earle's Balanced Salt Solution 2.2 g/L NaHCO3, stable glutamine w/o PR | Biochrom | FG-0385 | |
| MEM with Earle's Balanced Salt Solution with 2.2 g/L NaHCO3, stable glutamine, Phenolred | Biochrom | FG-0325 | |
| MitoTracker® Deep Red FM | Thermo Fisher Scientific | M22426 | dye |
| MitoTracker® Green FM | Thermo Fisher Scientific | M7514 | dye |
| Multi-mode-optical polarization maintaining monomode fiber | Pointsource/Qioptiq | KineFLEX | |
| NHS-PEG-MAL, Rapp Polymer | Rapp Polymere GmbH Tübingen | coverslip coating | |
| non-essential amino acids (NEAA) | Biochrom | #0802E | |
| PEG 800 (Polyethylene glycol) 10 % | Carl Roth GmbH | Art No. 0263.1 | coverslip coating |
| Penicillin/Streptomycin | Biochrom | #0122E | |
| Plasmid for PINK1-Halo7-Tag expression | Beinlich et al., ACS Chemical Biology 2015 | ||
| Poly-L-lysine (1.2 mg/ml) | Sigma-Aldrich & Co. | Cat. No.P9155 | coverslip coating |
| RGD Peptide (Ac-CGRGDS-COOH) | Coring System Diagnostix GmbH, Gernsheim | coverslip coating / Intergrin receptor motif | |
| Silicon Rhodamine linked to HaloTag®-Ligand (SiRHTL) | personal gift from Kai Johnson | dye | |
| Software analysis plugin | self-written C. P. Richter, Biophysik Osnabrück | SLIMFAST 16g | |
| Tetramethylrhodamine / SNAP-Cell® TMR-Star linked to SNAP-Ligand (TMRstar) | New England Biolab® | S9105S | dye |
| Tetramethylrhodamine linked to HaloTag®-Ligand (TMRHTL) | Promega | G8251 | dye |
| TIRF condensor | Olympus | Cell^TIRF MITICO System | TIRF condensor |
| TIRF microscope controlling software | Olympus cellSens 1.12 | ||
| TIRF objective | Olympus | 150x oil objective (N.A. 1.45; Olympus UAPO) | |
| Trypsin/EDTA 10x | Biochrom | #0266 | |
| Water H2O 99,5 % Rotipuran® Low organic | Carl Roth GmbH | Art. No. HN57.1 |
Referências
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Citar este artigo
Appelhans, T., Beinlich, F. R., Richter, C. P., Kurre, R., Busch, K. B. Multi-color Localization Microscopy of Single Membrane Proteins in Organelles of Live Mammalian Cells. J. Vis. Exp. (136), e57690, doi:10.3791/57690 (2018).