Microscopía de localización de varios colores solo de proteínas de membrana en organelos de células mamíferas vivas
Summary
Aquí, presentamos un protocolo para la localización de varios color de proteínas de membrana único en organelos de células vivas. Para colocar fluoróforos, se usan proteínas auto etiquetadas. Proteínas, situadas en compartimientos diferentes membranas de la mismo orgánulo, se pueden localizar con una precisión de ~ 18 nm.
Abstract
Conocimiento sobre la localización de proteínas en subcompartimientos celulares es crucial para entender su función específica. Aquí, presentamos una técnica de súper-resolución que permite la determinación de la microcompartments que son accesibles para las proteínas generando localización y seguimiento de los mapas de estas proteínas. Por otra parte, por microscopia de la localización de varios colores, la localización y seguimiento de perfiles de proteínas en subcompartimientos diferentes se obtienen simultáneamente. La técnica es específica para las células vivas y se basa en la proyección de imagen repetitiva de proteínas de membrana móvil único. Proteínas de interés son genéticamente fusionadas con etiquetas auto etiquetados específicos, supuestos. Estas etiquetas son enzimas que reaccionan con el sustrato de manera covalente. Conjugado a estos sustratos son tintes fluorescentes. Reacción de las proteínas de la enzima etiquetada con la fluorescencia etiquetada resultados de sustratos en proteínas etiquetadas. Aquí, Tetramethylrhodamine (TMR) y silicio rodamina (SiR) se utilizan como tintes fluorescentes a los sustratos de las enzimas. Usando las concentraciones de sustrato en la pM a rango nM, etiquetado sub-estequiométrica se consigue que se traduce en señales distintas. Estas señales se localizan con ~ 15 – 27 precisión nm. La técnica permite la proyección de imagen de varios color de moléculas individuales, por el que el número de colores es limitado por los tintes disponibles permeable a la membrana y el repertorio de auto etiquetado de las enzimas. Mostramos la viabilidad de la técnica en la determinación de la localización de la enzima de control de calidad (Pten)-inducida quinasa 1 (PINK1) en diferentes compartimentos mitocondriales durante su proceso en relación con otras proteínas de membrana. La prueba verdadera interacciones físicas entre proteínas diferentemente marcadas solo por sola molécula traste o seguimiento Co es restringida, sin embargo, debido a los bajos grados de etiquetado disminuyen la probabilidad de tener dos proteínas adyacentes con la etiqueta al mismo tiempo. Mientras que la técnica es fuerte para las proteínas en los compartimientos de la membrana de la proyección de imagen, en la mayoría de los casos no es apropiado determinar la localización de proteínas solubles altamente móviles.
Introduction
El objetivo de este protocolo es proporcionar un método de imagen para localizar y rastrear las proteínas de membrana solo dentro de células vivas. Llamamos a este método de seguimiento y localización de la microscopia (TALM)1,2. Como microscopia de reconstrucción óptica estocástica (tormenta)3 y microscopía de fluorescencia fotoactivación localización ((F) PALM)4,5, TALM es una técnica de localización de fluorescencia basada en la molécula sola. Sin embargo, es distinta de la manera que la movilidad de las proteínas de la membrana en combinación con imágenes repetitivas de la misma etiqueta molécula en diversas posiciones revela el microcompartment que es accesible para la proteína móvil. En otras palabras, las localizaciones posibles de la proteína se encuentran en la arquitectura de las organelas y por la movilidad de la proteína1. El método es complementario a varios otros súper resolución técnicas6,7,8 porque revela la trayectoria y localización mapas por proyección de imagen móvil proteínas. El etiquetado se basa en el uso de proteínas de fusión genéticamente que son fluorescentes por sí no. Estas proteínas de fusión son auto etiquetado enzimas que reaccionan covalentemente con un substrato conjugado a un tinte. Este procedimiento tiene la ventaja de que el grado del etiquetado puede ser controlado por la cantidad de sustrato añadido. Además, permite variar el color de la fluorescencia, dependiendo del tinte conjugado solicitada. Varios auto etiquetados enzima-tags están disponibles9. Otra ventaja de usar auto etiquetado enzima etiquetas es, que los tintes conjugados suelen ser más estables y más brillante de proteínas fluorescentes1 y proteínas individuales por lo tanto se pueden grabar más y más precisamente hasta que se blanquean. Esto permite la grabación de las trayectorias de proteínas móviles y la extracción de coeficientes de difusión10,11.
Aquí, demostramos la factibilidad de TALM con proteínas de la membrana mitocondrial, pero también puede ser aplicado para otras proteínas de membrana cellular intra y extraurbano, incluyendo células diferentes tipos12,13. Mostramos que TALM multicolor más permite la distinción simultánea de proteínas en diferentes subcompartimientos en complementación a los súper resolución fluorescencia microscopía técnicas14,15, 16. TALM es compatible con celular directo imágenes17. La física de la foto del elegido rhodamines Tetramethylrhodamine (TMR) y silicio-Rhodamien (SiR), en particular su brillo y su estabilidad, permite a las proteínas de membrana único registro varios fotogramas proporcionar mapas de trayectoria (y localización). Sin embargo, TALM está limitada para la localización de proteínas solubles con coeficientes de difusión alta puesto que el desenfoque de movimiento es demasiado alto y los fotones recogidos por frame son demasiado bajos para la localización correcta. Además, TALM requiere menos energía de la excitación que por ejemplo tormenta o agotamiento estimulado de emisión (STED) microscopía6,7, reduciendo efectos phototoxic. Esto es importante, puesto que estrés fototóxico a menudo afecta la morfología organellar18 y así movilidad análisis19. En suma, presentamos varios color TALM en células vivas como una técnica que llena un vacío entre los métodos de microscopía de localización tormenta/STED/Palma (F) y las técnicas que analizan la movilidad de la proteína tales como recuperación de fluorescencia Tras Fotoblanqueo (FRAP)20 ,21, correlación de fluorescencia (FCS) la espectroscopia22y fluorescencia cross correlación espectroscopia (FCCS)11,23.
Protocol
Representative Results
Discussion
Aquí, se presentó una técnica para la localización de la sola molécula bicolor de proteínas de membrana móvil. Tras el protocolo, proteínas de membrana están fusionadas a auto etiquetado de proteínas que reaccionan con los tintes del rhodamine TMR y SiR conjugado con sus respectivos sustratos. Rodamina tintes son brillante y Fotoestables y así permitir repetitiva imagen1. Para un rendimiento exitoso, varias condiciones y temas críticos tienen que ser tenidas en cuenta.
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The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores desean agradecer al grupo de Biofísica y Jacob Piehler en la Universidad de Osnabrück para apoyo continuo, Wladislaw Kohl para asistencia técnica y preparación del material y la Junta de CellNanOs para proporcionar microscopios para uso. El proyecto fue financiado por el SFB 944.
Materials
| (2-(4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazinyl)-ethanesulfonic acid, 1 M) (HEPES) | Biochrom | #1104E | |
| DC1: Dichroid beam splitter | Chroma | 640 dcxr | NC506031 |
| DC2: Polychroic Mirror, beamsplitter | Chroma | zt405/488/561/640rpc | discontinued |
| Dulbecco´s Phosphate-Buffered Saline (PBS) 1x (w/o Ca & Mg) | Sigma-Aldrich & Co. | #RNBF8311 | |
| Earle´s MEM without phenol red, without L-Glutamine and without NaHCO3 containing 1% FBS, 0.1% HEPES, 0.1% NEAA, 0.1% Alanyl-L-Glutamine and 34.78% sodium hydrogen carbonate (NaHCO3 0.75g/l) | Imaging medium | ||
| Earle´s minimum essential medium (MEM) with phenol red, containing 1% Fetal Bovine Serum Superior (FBS), 0.1% HEPES (2-(4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazinyl)-ethanesulfonic acid, 1 M), and 0.1% non-essential amino acids (NEAA) | Growth medium | ||
| EF: Emission filter quadbandpass | AHF analysentechnik | F72-866 | Brightline HC 446 nm/523 nm/600 nm/677 nm |
| EMCCD camera | Andor | Andor iXON 897 | EMCCD camera |
| Emission filter QuadView filter cubes, orange | AHF analysentechnik | F39-637 | bandpass 582 – 619 nm |
| Emission filter QuadView filter cubes, red | Chroma | bandpass 655 – 725 nm (HQ 690/70) | |
| FBS (Fetal bovine serum) superior | Biochrom | S0615 | |
| Fluorescent beads: TetraSpeck™ Microspheres, 0.1 µm, fluorescent blue/green/orange/dark red | Thermo Fisher Scientific | T7279 | fluorescent microspheres |
| Glutamine | Biochrom | #0951C | |
| HeLa cells | DSMZ | ACC-57 | Cervical carcinoma cells from patient Henrietta Lacks |
| Hela cells CI::paGFP, stable | Muster et al., PLOSOne 2010 | ||
| Hela cells CV g::Halo7-Tag, stable | Appelhans et al., NanoLett 2012 | ||
| Hela cells Tom20::Halo7-Tag, stable | Appelhans et al., NanoLett 2012 | ||
| Image splitter | Photometrics | Dual-View QV2 | image splitter emission |
| Imaging processing software | ImageJ2 / Fiji | freeware | |
| Immersion Oil – ImmersolTM 518 F (ne = 1.518, ve = 45) | Carl Zeiss Jena GmbH | 444960-0000-000 | |
| Inverted epifluorescence microscope | Olympus IX-71/73/83 | ||
| Laser 561 nm, 200 mW | CrystaLaser | CL-561-200 | 561 nm emission |
| Laser 642 nm, 140 mW | Omicron | Luxx-642-140 | 642 nm emission |
| MATLAB | MathWorks | version R2013a | |
| MEM with Earle's Balanced Salt Solution 2.2 g/L NaHCO3, stable glutamine w/o PR | Biochrom | FG-0385 | |
| MEM with Earle's Balanced Salt Solution with 2.2 g/L NaHCO3, stable glutamine, Phenolred | Biochrom | FG-0325 | |
| MitoTracker® Deep Red FM | Thermo Fisher Scientific | M22426 | dye |
| MitoTracker® Green FM | Thermo Fisher Scientific | M7514 | dye |
| Multi-mode-optical polarization maintaining monomode fiber | Pointsource/Qioptiq | KineFLEX | |
| NHS-PEG-MAL, Rapp Polymer | Rapp Polymere GmbH Tübingen | coverslip coating | |
| non-essential amino acids (NEAA) | Biochrom | #0802E | |
| PEG 800 (Polyethylene glycol) 10 % | Carl Roth GmbH | Art No. 0263.1 | coverslip coating |
| Penicillin/Streptomycin | Biochrom | #0122E | |
| Plasmid for PINK1-Halo7-Tag expression | Beinlich et al., ACS Chemical Biology 2015 | ||
| Poly-L-lysine (1.2 mg/ml) | Sigma-Aldrich & Co. | Cat. No.P9155 | coverslip coating |
| RGD Peptide (Ac-CGRGDS-COOH) | Coring System Diagnostix GmbH, Gernsheim | coverslip coating / Intergrin receptor motif | |
| Silicon Rhodamine linked to HaloTag®-Ligand (SiRHTL) | personal gift from Kai Johnson | dye | |
| Software analysis plugin | self-written C. P. Richter, Biophysik Osnabrück | SLIMFAST 16g | |
| Tetramethylrhodamine / SNAP-Cell® TMR-Star linked to SNAP-Ligand (TMRstar) | New England Biolab® | S9105S | dye |
| Tetramethylrhodamine linked to HaloTag®-Ligand (TMRHTL) | Promega | G8251 | dye |
| TIRF condensor | Olympus | Cell^TIRF MITICO System | TIRF condensor |
| TIRF microscope controlling software | Olympus cellSens 1.12 | ||
| TIRF objective | Olympus | 150x oil objective (N.A. 1.45; Olympus UAPO) | |
| Trypsin/EDTA 10x | Biochrom | #0266 | |
| Water H2O 99,5 % Rotipuran® Low organic | Carl Roth GmbH | Art. No. HN57.1 |
Referências
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