Multi-farve lokalisering mikroskopi af enkelt Membranproteiner i organeller af levende pattedyrceller
Summary
Vi præsenterer her, en protokol for multi-farve lokalisering af enkelt Membranproteiner i organeller af levende celler. Du kan vedhæfte fluorophores, bruges selvstændig mærkning proteiner. Proteiner, beliggende i forskellige membraner rum af den samme organelle, kan lokaliseres med en nøjagtighed på ~ 18 nm.
Abstract
Viden om lokalisering af proteiner i cellulære subcompartments er afgørende for at forstå deres specifikke funktion. Vi præsenterer her, en super-opløsning teknik, der giver mulighed for bestemmelse af den microcompartments, der er tilgængelige for proteiner ved generering af lokalisering og sporing kort over disse proteiner. Desuden af multi-farve lokalisering mikroskopi, er lokalisering og sporing af profiler af proteiner i forskellige subcompartments opnået samtidigt. Teknikken, der er specifikke for levende celler og er baseret på den gentagne billeddannelse af enkelt mobile Membranproteiner. Proteiner af interesse er genetisk sammensmeltet med specifikke, såkaldte selvstændig mærkning tags. Disse tags er enzymer, der reagerer med et substrat i en kovalent måde. Konjugeret til disse substrater er fluorescerende farvestoffer. Reaktion af de enzym-tagged proteiner med fluorescens mærket substrater resultater i mærket proteiner. Her, der Tetramethylrhodamine (TMR) og silicium rodamin (SiR) anvendes som fluorescerende farvestoffer på substrater af enzymer. Ved hjælp af substrat koncentrationer i pM til nM rækkevidde, opnås sub støkiometriske mærkning der resulterer i forskellige signaler. Disse signaler er lokaliseret med ~ 15 – 27 nm præcision. Teknikken, der giver mulighed for multi-farve billeddannelse af enkelte molekyler, hvorved antallet af farver er begrænset af de tilgængelige membran-gennemtrængelige farvestoffer og repertoire af selvstændig mærkning enzymer. Vi viser gennemførligheden af teknikken ved bestemmelse af lokalisering af kvalitetskontrol enzym (PT)-induceret kinase 1 (PINK1) i forskellige mitokondrie rum under behandling i forhold til andre Membranproteiner. Test for sande fysiske vekselvirkninger mellem forskelligt mærket enkelt proteiner af enkelt molekyle FRET eller co tracking er begrænset, selv, fordi de lave mærkning grader mindske sandsynligheden for at have to tilstødende proteiner mærket på samme tid. Mens teknikken er stærk for imaging proteiner i membranen rum, i de fleste tilfælde er det ikke hensigtsmæssigt at bestemme lokalisering af stærkt mobile opløselige proteiner.
Introduction
Målet med denne protokol er at give en billedmetoden til at lokalisere og spore enkelt Membranproteiner i levende celler. Vi kalder denne metode sporing og lokalisering mikroskopi (TALM)1,2. Ligesom stokastiske optisk genopbygning mikroskopi (STORM)3 og fluorescens Photoactivation lokalisering mikroskopi ((F) PALM)4,5er TALM et enkelt molekyle-baserede fluorescens lokalisering teknik. Men det er forskellige i den måde, at mobilitet på Membranproteiner i kombination med gentagne billeddannelse af samme mærket molekyle på forskellige positioner afslører den microcompartment, der er tilgængelige for den mobile protein. Med andre ord er de mulige lokaliseringer af protein fastsat i arkitekturen i organelle og mobilitet af protein1. Metoden er supplement til forskellige andre super-resolution teknikker6,7,8 , fordi det afslører lokalisering og bane kort af imaging mobile proteiner. Mærkning er baseret på ved hjælp af gensplejsede fusion proteiner, der er i sig selv ikke-fluorescerende. Disse fusion proteiner selvstændig mærkning enzymer, der reagerer kovalent med et substrat, konjugeret med et farvestof. Denne fremgangsmåde har den fordel, at mærkning graden kan blive kontrolleret af mængden af tilsat substrat. Desuden, det giver mulighed for at variere farven af fluorescens, afhængigt af den valgte konjugeret farvestof. Flere selvstændige mærkning enzym-tags er tilgængelig9. En anden fordel ved at bruge selvstændige mærkning enzym-tags er, at de konjugerede farvestoffer normalt er mere stabile og lysere end fluorescerende proteiner1 og individuelle proteiner derfor kan registreres længere og mere præcist indtil de er bleget. Dette giver mulighed for optagelse af baner af mobile proteiner og udvinding af diffusion koefficienter10,11.
Her vi demonstrere muligheden for at TALM med mitokondrielle Membranproteiner, men det kan også anvendes for andre intra og ekstra cellular Membranproteiner, herunder forskellige typer12,13. Vi viser, at multi-farve TALM yderligere giver mulighed for samtidige sondringen af proteiner i forskellige subcompartments i komplementering til eksisterende super-resolution Fluorescens mikroskopi teknikker14,15, 16. TALM er kompatibel med levende celle imaging17. Foto-fysik af de valgte rhodamines Tetramethylrhodamine (TMR) og silicium-Rhodamien (SiR), navnlig deres lysstyrke og stabilitet, gør det muligt at optage enkelt Membranproteiner over flere rammer giver lokalisering (og bane) kort. TALM er dog begrænset til lokalisering af opløselige proteiner med høj diffusion koefficienter, da motion blur er for høj og de indsamlede fotoner pr. ramme er for lavt for korrekt lokalisering. Desuden kræver TALM mindre excitation strøm end for eksempel STORM eller stimuleret Emission udtynding (STED) mikroskopi6,7, reducere fototoksiske effekter. Det er vigtigt, eftersom fototoksisk stress påvirker ofte organellar morfologi18 og dermed mobilitet analyse19. I sum, vi præsenterer multi-farve TALM i levende celler som en teknik, der udfylder et hul mellem lokalisering mikroskopi metoder STORM/STED / (F) PALM og teknikker, der analyserer protein mobilitet såsom fluorescens opsving efter photobleaching (FRAP)20 ,21, fluorescens korrelation spektroskopi (FCS)22og fluorescens cross korrelation spektroskopi (FCCS)11,23.
Protocol
Representative Results
Discussion
Her, blev en teknik til dobbelt farve enkelt molekyle lokalisering af mobile Membranproteiner præsenteret. Efter protokollen, Membranproteiner er sammenvokset til selvstændig mærkning proteiner, der reagerer med rodamin farvestoffer TMR og SiR konjugeret til deres respektive substrater. Rodamin farvestoffer er lyse og photostable og dermed mulighed for gentagne billeddannelse1. For vellykket præstation skal flere betingelser og kritiske emner holdes for øje.
For de…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne vil gerne takke Biofysik gruppe og Jacob Piehler på universitetet i Osnabrück for kontinuerlig støtte, Wladislaw Kohl for teknisk bistand og udarbejdelse af materiale og CellNanOs bestyrelsen for at levere mikroskoper til brug. Projektet blev finansieret af SFB 944.
Materials
| (2-(4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazinyl)-ethanesulfonic acid, 1 M) (HEPES) | Biochrom | #1104E | |
| DC1: Dichroid beam splitter | Chroma | 640 dcxr | NC506031 |
| DC2: Polychroic Mirror, beamsplitter | Chroma | zt405/488/561/640rpc | discontinued |
| Dulbecco´s Phosphate-Buffered Saline (PBS) 1x (w/o Ca & Mg) | Sigma-Aldrich & Co. | #RNBF8311 | |
| Earle´s MEM without phenol red, without L-Glutamine and without NaHCO3 containing 1% FBS, 0.1% HEPES, 0.1% NEAA, 0.1% Alanyl-L-Glutamine and 34.78% sodium hydrogen carbonate (NaHCO3 0.75g/l) | Imaging medium | ||
| Earle´s minimum essential medium (MEM) with phenol red, containing 1% Fetal Bovine Serum Superior (FBS), 0.1% HEPES (2-(4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazinyl)-ethanesulfonic acid, 1 M), and 0.1% non-essential amino acids (NEAA) | Growth medium | ||
| EF: Emission filter quadbandpass | AHF analysentechnik | F72-866 | Brightline HC 446 nm/523 nm/600 nm/677 nm |
| EMCCD camera | Andor | Andor iXON 897 | EMCCD camera |
| Emission filter QuadView filter cubes, orange | AHF analysentechnik | F39-637 | bandpass 582 – 619 nm |
| Emission filter QuadView filter cubes, red | Chroma | bandpass 655 – 725 nm (HQ 690/70) | |
| FBS (Fetal bovine serum) superior | Biochrom | S0615 | |
| Fluorescent beads: TetraSpeck™ Microspheres, 0.1 µm, fluorescent blue/green/orange/dark red | Thermo Fisher Scientific | T7279 | fluorescent microspheres |
| Glutamine | Biochrom | #0951C | |
| HeLa cells | DSMZ | ACC-57 | Cervical carcinoma cells from patient Henrietta Lacks |
| Hela cells CI::paGFP, stable | Muster et al., PLOSOne 2010 | ||
| Hela cells CV g::Halo7-Tag, stable | Appelhans et al., NanoLett 2012 | ||
| Hela cells Tom20::Halo7-Tag, stable | Appelhans et al., NanoLett 2012 | ||
| Image splitter | Photometrics | Dual-View QV2 | image splitter emission |
| Imaging processing software | ImageJ2 / Fiji | freeware | |
| Immersion Oil – ImmersolTM 518 F (ne = 1.518, ve = 45) | Carl Zeiss Jena GmbH | 444960-0000-000 | |
| Inverted epifluorescence microscope | Olympus IX-71/73/83 | ||
| Laser 561 nm, 200 mW | CrystaLaser | CL-561-200 | 561 nm emission |
| Laser 642 nm, 140 mW | Omicron | Luxx-642-140 | 642 nm emission |
| MATLAB | MathWorks | version R2013a | |
| MEM with Earle's Balanced Salt Solution 2.2 g/L NaHCO3, stable glutamine w/o PR | Biochrom | FG-0385 | |
| MEM with Earle's Balanced Salt Solution with 2.2 g/L NaHCO3, stable glutamine, Phenolred | Biochrom | FG-0325 | |
| MitoTracker® Deep Red FM | Thermo Fisher Scientific | M22426 | dye |
| MitoTracker® Green FM | Thermo Fisher Scientific | M7514 | dye |
| Multi-mode-optical polarization maintaining monomode fiber | Pointsource/Qioptiq | KineFLEX | |
| NHS-PEG-MAL, Rapp Polymer | Rapp Polymere GmbH Tübingen | coverslip coating | |
| non-essential amino acids (NEAA) | Biochrom | #0802E | |
| PEG 800 (Polyethylene glycol) 10 % | Carl Roth GmbH | Art No. 0263.1 | coverslip coating |
| Penicillin/Streptomycin | Biochrom | #0122E | |
| Plasmid for PINK1-Halo7-Tag expression | Beinlich et al., ACS Chemical Biology 2015 | ||
| Poly-L-lysine (1.2 mg/ml) | Sigma-Aldrich & Co. | Cat. No.P9155 | coverslip coating |
| RGD Peptide (Ac-CGRGDS-COOH) | Coring System Diagnostix GmbH, Gernsheim | coverslip coating / Intergrin receptor motif | |
| Silicon Rhodamine linked to HaloTag®-Ligand (SiRHTL) | personal gift from Kai Johnson | dye | |
| Software analysis plugin | self-written C. P. Richter, Biophysik Osnabrück | SLIMFAST 16g | |
| Tetramethylrhodamine / SNAP-Cell® TMR-Star linked to SNAP-Ligand (TMRstar) | New England Biolab® | S9105S | dye |
| Tetramethylrhodamine linked to HaloTag®-Ligand (TMRHTL) | Promega | G8251 | dye |
| TIRF condensor | Olympus | Cell^TIRF MITICO System | TIRF condensor |
| TIRF microscope controlling software | Olympus cellSens 1.12 | ||
| TIRF objective | Olympus | 150x oil objective (N.A. 1.45; Olympus UAPO) | |
| Trypsin/EDTA 10x | Biochrom | #0266 | |
| Water H2O 99,5 % Rotipuran® Low organic | Carl Roth GmbH | Art. No. HN57.1 |
Referências
- Appelhans, T., Richter, C., Wilkens, V., Hess, S., Piehler, J., Busch, K. Nanoscale organization of mitochondrial microcompartments revealed by combining tracking and localization microscopy. Nano Letters. 12 (2), 610-616 (2012).
- Appelhans, T., Busch, K. Single Molecule Tracking and Localization of Mitochondrial Protein Complexes in Live Cells. Methods Mol Biol. 1567, 273-291 (2017).
- Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nat Methods. 3 (10), 793-795 (2006).
- Gould, T. J., Verkhusha, V. V., Hess, S. T. Imaging biological structures with fluorescence photoactivation localization microscopy. Nat Protoc. 4 (3), 291-308 (2009).
- Pennacchietti, F., Gould, T. J., Hess, S. T. The Role of Probe Photophysics in Localization-Based Superresolution Microscopy. Biophys J. 113 (9), 2037-2054 (2017).
- Wegel, E., Göhler, A., Lagerholm, B. C., Wainman, A. Imaging cellular structures in super-resolution with SIM, STED and Localisation Microscopy: A practical comparison. Scientific reports. , (2016).
- Pellett, P., et al. Two-color STED microscopy in living cells. Biomedical Optics Express. 2 (8), (2011).
- Ishigaki, M., et al. STED super-resolution imaging of mitochondria labeled with TMRM in living cells. Mitochondrion. 28, 79 (2016).
- Liss, V., Barlag, B., Nietschke, M., Hensel, M. Self-labelling enzymes as universal tags for fluorescence microscopy, super-resolution microscopy and electron microscopy. Scientific Reports. 5, 17740 (2015).
- Sergé, A., Bertaux, N., Rigneault, H., Marguet, D. Dynamic multiple-target tracing to probe spatiotemporal cartography of cell membranes. Nat Methods. 5 (8), (2008).
- Appelhans, T., Busch, K. B. Dynamic imaging of mitochondrial membrane proteins in specific sub-organelle membrane locations. Biophysical reviews. 9 (4), 345-352 (2017).
- Wilmes, S., et al. Triple-color super-resolution imaging of live cells: resolving submicroscopic receptor organization in the plasma membrane. Angewandte Chemie. 51 (20), 4868-4871 (2012).
- Niewidok, B., et al. Single-molecule imaging reveals dynamic biphasic partition of RNA-binding proteins in stress granules. J Cell Biol. , (2018).
- Wurm, C. A., Jakobs, S. Differential protein distributions define two sub-compartments of the mitochondrial inner membrane in yeast. FEBS Lett. 580 (24), 5628-5634 (2006).
- Schmidt, R., Wurm, C. A., Punge, A., Egner, A., Jakobs, S., Hell, S. W. Mitochondrial cristae revealed with focused light. Nano Lett. 9 (6), 2508-2510 (2009).
- Kukat, C., Wurm, C. A., Spahr, H., Falkenberg, M., Larsson, N. G., Jakobs, S. Super-resolution microscopy reveals that mammalian mitochondrial nucleoids have a uniform size and frequently contain a single copy of mtDNA. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (33), 13534-13539 (2011).
- Beinlich, F., Drees, C., Piehler, J., Busch, K. Shuttling of PINK1 between Mitochondrial Microcompartments Resolved by Triple-Color Superresolution Microscopy. ACS chemical biology. 10 (9), 1970-1976 (2015).
- Shim, S., et al. Super-resolution fluorescence imaging of organelles in live cells with photoswitchable membrane probes. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (35), 13978-13983 (2012).
- Sbalzarini, I., Mezzacasa, A., Helenius, A., Koumoutsakos, P. Effects of Organelle Shape on Fluorescence Recovery after Photobleaching. Biophysical Journal. 89 (3), 1482-1492 (2005).
- Reits, E., Neefjes, J. From fixed to FRAP: measuring protein mobility and activity in living cells. Nature Cell Biology. 3 (6), E145-E147 (2001).
- Goehring, N., Chowdhury, D., Hyman, A., Grill, S. FRAP Analysis of Membrane-Associated Proteins: Lateral Diffusion and Membrane-Cytoplasmic Exchange. Biophysical Journal. 99 (8), 2443-2452 (2010).
- Bacia, K., Haustein, E., Schwille, P. Fluorescence correlation spectroscopy: principles and applications. Cold Spring Harbor protocols. 2014 (7), 709-725 (2014).
- Sukhorukov, V., Dikov, D., Busch, K., Strecker, V., Wittig, I., Bereiter-Hahn, J. Determination of protein mobility in mitochondrial membranes of living cells. Biochimica et biophysica acta. 1798 (11), 2022-2032 (2010).
- Kim, T. K., Eberwine, J. H. Mammalian cell transfection: the present and the future. Anal Bioanal Chem. 397 (8), 3173-3178 (2010).
- Graham, F. L., van der Eb, A. J. A new technique for the assay of infectivity of human adenovirus 5 DNA. Virology. 52 (2), 456-467 (1973).
- Wedeking, T., et al. Spatiotemporally Controlled Reorganization of Signaling Complexes in the Plasma Membrane of Living Cells. Small. 11 (44), 5912-5918 (2015).
- Mironov, S. L., Ivannikov, M. V., Johansson, M. [Ca2+]i signaling between mitochondria and endoplasmic reticulum in neurons is regulated by microtubules. From mitochondrial permeability transition pore to Ca2+-induced Ca2+ release. J Biol Chem. 280 (1), 715-721 (2005).
- Poot, M., et al. Analysis of mitochondrial morphology and function with novel fixable fluorescent stains. J Histochem Cytochem. 44 (12), 1363-1372 (1996).
- Tokunaga, M., Imamoto, N., Sakata-Sogawa, K. Highly inclined thin illumination enables clear single-molecule imaging in cells (vol 5, pg 159). Nature Methods. 5 (5), 455 (2008).
- Elmokadem, A., Yu, J. Optimal Drift Correction for Superresolution Localization Microscopy with Bayesian Inference. Biophys J. 109 (9), 1772-1780 (2015).
- Barlag, B., et al. Single molecule super-resolution imaging of proteins in living Salmonella enterica using self-labelling enzymes. Sci Rep. 6, 31601 (2016).
- Tokunaga, M., Imamoto, N., Sakata-Sogawa, K. Highly inclined thin illumination enables clear single-molecule imaging in cells. Nature Methods. 5 (2), 159-161 (2008).
- Mortensen, K. I., Churchman, L. S., Spudich, J. A., Flyvbjerg, H. Optimized localization analysis for single-molecule tracking and super-resolution microscopy. Nat Methods. 7 (5), 377-381 (2010).
- Jin, S., Youle, R. J. PINK1- and Parkin-Mediated Mitophagy at a Glance. Journal of Cell Science. 125, 795-799 (2013).
- Yamano, K., Youle, R. J. PINK1 is degraded through the N-end rule pathway. Autophagy. 9 (11), 1758-1758 (2013).
- Wiedemann, N., et al. Machinery for protein sorting and assembly in the mitochondrial outer membrane. Nature. 424 (6948), 565-571 (2003).
- Thompson, R., Larson, D., Webb, W. Precise Nanometer Localization Analysis for Individual Fluorescent Probes. Biophysical Journal. 82 (5), 2775-2783 (2002).
