एक सरल और Reproducible विधि हौसले से अलग चूहे मस्तिष्क Microvessels से झिल्ली के नमूने तैयार करने के लिए
Summary
यहां, चूहे मस्तिष्क microvessels के अलगाव के लिए एक विधि और झिल्ली के नमूनों की तैयारी के लिए वर्णित है । इस प्रोटोकॉल व्यक्तिगत पशुओं से स्वीकार्य प्रोटीन की उपज के साथ समृद्ध microvessel नमूनों के उत्पादन का स्पष्ट लाभ है । नमूने तो मस्तिष्क microvascular endothelium में मजबूत प्रोटीन विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।
Abstract
रक्त मस्तिष्क बाधा (BBB) विभिन्न pathophysiological और औषधीय उत्तेजनाओं का जवाब है कि एक गतिशील बाधा ऊतक है । इन उत्तेजनाओं से उत्पन्न इस तरह के परिवर्तन बहुत मस्तिष्क को दवा वितरण मिलाना कर सकते हैं और, विस्तार से, केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस) रोगों के उपचार में काफी चुनौतियों का कारण. कई BBB परिवर्तन है कि pharmacotherapy को प्रभावित, प्रोटीन है कि स्थानीय और endothelial कोशिकाओं के स्तर पर व्यक्त शामिल हैं । दरअसल, स्वास्थ्य और रोग में BBB फिजियोलॉजी पर इस तरह के ज्ञान का इन झिल्ली प्रोटीन के अध्ययन में काफी रुचि छिड़ी हुई है. एक बुनियादी विज्ञान अनुसंधान के दृष्टिकोण से, यह मस्तिष्क ऊतक से microvessels के अलगाव के लिए एक सरल लेकिन मजबूत और reproducible विधि प्रयोगात्मक पशुओं से काटा के लिए एक आवश्यकता का तात्पर्य । आदेश में हौसले से अलग microvessels से झिल्ली के नमूने तैयार करने के लिए, यह आवश्यक है कि नमूना तैयारी endothelial कोशिकाओं में समृद्ध किया जा सकता है, लेकिन neurovascular इकाई के अन्य कोशिका प्रकार की उपस्थिति में सीमित (यानी, astrocytes, microglia, न्यूरॉन्स, pericytes) । एक जोड़ा लाभ के लिए व्यक्तिगत पशुओं से नमूने तैयार करने की क्षमता है ताकि एक प्रयोगात्मक जनसंख्या में प्रोटीन अभिव्यक्ति की असली परिवर्तनशीलता पर कब्जा करने के लिए । इस पांडुलिपि में, एक विधि है कि चूहे मस्तिष्क microvessels और झिल्ली के नमूनों की तैयारी अलगाव के लिए उपयोग किया जाता है के बारे में विवरण प्रदान की जाती हैं । Microvessel संवर्धन, व्युत्पंन नमूनों से, जहां dextran नमूना बफर में शामिल है चार केंद्रापसारक कदम का उपयोग करके हासिल की है । इस प्रोटोकॉल को आसानी से अपने स्वयं के विशिष्ट अनुप्रयोगों के लिए अंय प्रयोगशालाओं द्वारा अनुकूलित किया जा सकता है । इस प्रोटोकॉल से उत्पंन नमूनों के लिए प्रोटीन विश्लेषण प्रयोगों है कि बहुत शारीरिक, pathophysiological, और औषधीय उत्तेजनाओं को BBB प्रतिक्रियाओं की समझ सहायता कर सकते है से मजबूत प्रयोगात्मक डेटा उपज दिखाया गया है ।
Introduction
रक्त मस्तिष्क बाधा (BBB) केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस) और प्रणालीगत संचलन के बीच इंटरफेस पर मौजूद है और मस्तिष्क homeostasis के रखरखाव में एक आवश्यक भूमिका निभाता है । विशेष रूप से, BBB कार्य करने के लिए ठीक मस्तिष्क extracellular द्रव में घुला हुआ सांद्रता नियंत्रण और कुशलतापूर्वक उन पोषक तत्वों है कि मस्तिष्क ऊतक द्वारा आवश्यक है की आपूर्ति के लिए सीएनएस1की काफी चयापचय मांगों को पूरा । इन भूमिकाओं का मतलब है कि BBB, जो microvascular endothelial सेल के स्तर पर मुख्य रूप से मौजूद है, असतत तंत्र है कि कुछ पदार्थों को मस्तिष्क पैरेन्काइमा का उपयोग करने में सक्षम है, जबकि यह सुनिश्चित करना है कि संभावित हानिकारक xenobiotics नहीं कर सकते है अधिकारी चाहिए जमा. दरअसल, मस्तिष्क microvascular endothelial कोशिकाओं fenestrated और प्रदर्शन सीमित pinocytosis नहीं कर रहे हैं, जो गैर की कमी-चयनात्मक पारगम्यता सुनिश्चित करता है2. इसके अतिरिक्त, मस्तिष्क microvessel endothelial कोशिकाओं तंग जंक्शन और adherens जंक्शन प्रोटीन कि आसंन endothelial कोशिकाओं के बीच एक भौतिक “मुहर” फार्म और बहुत मस्तिष्क में रक्त जनित पदार्थों के paracellular प्रसार को प्रतिबंधित करने के लिए कार्य एक्सप्रेस पैरेन्काइमा. दरअसल, अंतर्जात और exogenous पदार्थों के चयनात्मक पारगम्यता और समाप्ति ट्रांसपोर्टरों की कार्यात्मक अभिव्यक्ति की आवश्यकता है3। कुल मिलाकर, तंग जंक्शनों, adherens जंक्शनों, और ट्रांसपोर्टरों BBB के अद्वितीय बाधा गुणों को बनाए रखने के लिए संगीत कार्यक्रम में काम करते हैं ।
BBB एक गतिशील बाधा है कि शारीरिक, pathophysiological, और औषधीय उत्तेजनाओं का जवाब है । उदाहरण के लिए, हाइपोक्सिया/reऑक्सिजन तनाव महत्वपूर्ण तंग जंक्शन प्रोटीन की अभिव्यक्ति का नियमन करने के लिए दिखाया गया है (यानी, occludin, zonulae occluden-1 (ZO-1)), जो संवहनी मार्करों के लिए वृद्धि की paracellular पारगम्यता के साथ जुड़ा हुआ है ऐसे सुक्रोज4,5,6के रूप में । इसी तरह की टिप्पणियों दर्दनाक मस्तिष्क चोट7 और परिधीय भड़काऊ दर्द की सेटिंग में BBB पर किया गया है8,9. ये वही बीमारियां भी BBB10,11,12,13,14में परिवहन तंत्र मिलाना कर सकते हैं । दरअसल, हाइपोक्सिया/पुनर्ऑक्सीजन चोट Oatp1a4 में कार्बनिक आयनों परिवहन पॉलीपेप्टाइड 1a4 (BBB) के कार्यात्मक अभिव्यक्ति को बढ़ाता है, जो विशिष्ट Oatp परिवहन सब्सट्रेट के रक्त में मस्तिष्क परिवहन में उल्लेखनीय वृद्धि करने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं taurocholate और atorvastatin13. BBB गुण भी खुद pharmacotherapy द्वारा बदला जा सकता है, एक तंत्र है कि मस्तिष्क में दवा प्रभावशीलता में दोनों गहरा परिवर्तन और नशीली दवाओं के लिए बातचीत के लिए एक आधार बनाने के लिए कर सकते हैं । उदाहरण के लिए, एसिटामिनोफेन मस्तिष्क microvascular endothelial कोशिकाओं में परमाणु रिसेप्टर संकेतन तंत्र लक्ष्य, महत्वपूर्ण समाप्ति ट्रांसपोर्टर पी ग्लाइकोप्रोटीन (पी जीपी) के कार्यात्मक अभिव्यक्ति बढ़ जाती है, और समय पर निर्भर analgesia को संशोधित अफ़ीम, एक opioid एनाल्जेसिक दवा द्वारा संमानित और पी जीपी परिवहन सब्सट्रेट15की स्थापना की । BBB परिवर्तन की एक पूरी तरह से समझ, कि रोगों द्वारा या दवाओं द्वारा प्रेरित किया जा सकता है, यह भी पहचान और विशिष्ट विनियामक तंत्र है कि इन संशोधनों को नियंत्रित करने के लक्षण वर्णन की आवश्यकता है । दरअसल, असतत संकेत मार्ग मस्तिष्क microvascular endothelial कोशिकाओं है कि तंग जंक्शन प्रोटीन की आणविक अभिव्यक्ति नियंत्रण में पहचान की गई है16,17 और ट्रांसपोर्टरों15, 18,19. एक साथ ले लिया, इन टिप्पणियों से संकेत मिलता है कि जटिल आणविक मार्ग BBB तंग जंक्शनों और ट्रांसपोर्टरों दोनों स्वास्थ्य और रोग में के नियमन में शामिल हैं ।
BBB के अध्ययन में एक महत्वपूर्ण चुनौती प्रयोगात्मक पशुओं से व्युत्पंन मस्तिष्क ऊतक से microvessels के अलगाव के लिए एक सरल और प्रभावी विधि की पूर्ण आवश्यकता है और झिल्ली के नमूनों की बाद में तैयारी है । इन नमूनों को तैयार किया जाना चाहिए ताकि वे दोनों मस्तिष्क microvascular endothelial कोशिकाओं में समृद्ध हो और अन्य कोशिका प्रकार की उपस्थिति में सीमित. पिछले कई वर्षों में, मूषक मस्तिष्क से microvasculature के अलगाव के लिए कई तरीके वैज्ञानिक साहित्य13,20,21,22में सूचित किया गया है । यह लेख चूहे मस्तिष्क से microvessels के अलगाव के लिए एक सरल, मजबूत, और reproducible विधि का वर्णन करता है और endothelial झिल्ली-समृद्ध नमूनों कि प्रोटीन अभिव्यक्ति के विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है की तैयारी के लिए । इस microvessel अलगाव प्रोटोकॉल का एक लाभ के लिए उच्च गुणवत्ता के नमूना तैयार करने और एक व्यक्ति प्रयोगात्मक पशु से पर्याप्त प्रोटीन उपज के साथ प्राप्त करने की क्षमता है । यह प्रोटीन अभिव्यक्ति में अंतर-पशु परिवर्तनशीलता के विचार को सक्षम बनाता है । इस प्रोटोकॉल में इस तरह के एक अग्रिम बहुत BBB अध्ययन की मजबूती में सुधार हुआ है क्योंकि अधिक अनुमान (या के तहत अनुमान) BBB में प्रोटीन परिवर्तन के सच परिमाण के अब बचा जा सकता है । इसके अतिरिक्त, dextran के साथ कई केंद्रापसारक कदम के शामिल किए जाने के प्रयोगात्मक नमूनों में microvessels के सुधार संवर्धन सक्षम बनाता है, जबकि ऐसे ंयूरॉंस के रूप में अवांछित सेलुलर घटकों को हटाने की सुविधा ।
Protocol
Representative Results
Discussion
इस लेख में, microvessels से झिल्ली प्रोटीन नमूने तैयार करने का एक सरल और प्रभावी तरीका हौसले से अलग चूहे मस्तिष्क ऊतक से पृथक वर्णित है । चूहे के अलगाव के लिए कई दृष्टिकोण मस्तिष्क microvessels और/या अलग microvasculature से झिल्ली…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
यह काम स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थानों से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था (R01-NS084941) और एरिजोना जैव चिकित्सा अनुसंधान आयोग (ADHS16-162406) PTR करने के लिए । WA स्वास्थ्य प्रशिक्षण अनुदान (T32-HL007249) के एक राष्ट्रीय संस्थानों को पूर्व डॉक्टरेट नियुक्ति से पिछले समर्थन प्राप्त हुआ है ।
Materials
| Protease Inhibitor Cocktail | Sigma-Aldrich | #P8340 | Component of brain microvessel buffer |
| D-mannitol | Sigma-Aldrich | #M4125 | Component of brain microvessel buffer |
| EGTA | Sigma-Aldrich | #E3889 | Component of brain microvessel buffer |
| Trizma Base | Sigma-Aldrich | #T1503 | Component of brain microvessel buffer |
| Dextran (MW 75,000) | Spectrum Chemical Mftg Corp | #DE125 | Dextran used in centrifugation steps to separate microvessels from brain parenchyma |
| Zetamine | MWI Animal Health | #501072 | General anesthetic |
| Xylazine | Western Medical Supply | #5530 | General anesthetic |
| 0.9% saline solution | Western Medical Supply | N/A | General anesthetic diluent |
| Filter Paper (12.5 cm diameter) | VWR | #28320-100 | Used for removal of meninges from brain tissue |
| Centrifuge Tubes | Sarstedt | #60.540.386 | Disposable tubes used for dextran centrifugation steps |
| Pierce™ Coomassie Plus (Bradford) Assay | ThermoFisher Scientific | #23236 | Measurement of protein concentration in membrane preparations |
| Wheaton Overhead Power Homogenizer | DWK Life Sciences | #903475 | Required for homogenization of samples |
| 10.0ml glass mortar and pestle tissue grinder | DWK Life Sciences | #358039 | Required for homogenization of samples |
| Hydrochloric Acid | Sigma-Aldrich | #H1758 | Required for pH adjustment of buffers |
| Bovine Serum Albumin | ThermoFisher Scientific | #23210 | Protein standard for Bradford Assay |
| Standard Forceps | Fine Science Tools | #91100-12 | Used for dissection of brain tissue |
| Friedman-Pearson Rongeurs | Fine Science Tools | #16020-14 | Used for opening skull to isolate brain |
| 50 ml conical centrifuge tubes | ThermoFisher Scientific | #352070 | Used for collection of brain tissue following isolation |
| Glass Pasteur Pipets | ThermoFisher Scientific | #13-678-20C | Used for aspiration of cellular debris following dextran spins |
| Ethanol, anhydrous | Sigma-Aldrich | #459836 | Used for cleaning tissue grinder; diluted to 70% with distilled water |
| Ultracentrifuge tubes | Beckman-Coulter | #41121703 | Used for ultracentrifugation of samples |
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