Beoordelen van de levensvatbaarheid van een synthetische bacteriële Consortium op de In Vitro -Interface van het Gut-Host-microbe
Summary
Gut host-microbe interacties werden geschat aan de hand van een nieuwe benadering van het combineren van een synthetische mondelinge Gemeenschap, in vitro gastro-intestinale spijsvertering en een model van het epitheel van de dunne darm. Presenteren we een methode die aangepast worden kan voor de beoordeling van de cel invasie van ziekteverwekkers en multispecifieke biofilms, of zelfs om te testen op het overlevingsvermogen van probiotische formuleringen.
Abstract
Het samenspel tussen host en microbiota heeft al lang erkend en uitgebreid beschreven. De mond is vergelijkbaar met andere delen van het maag-darmkanaal, zoals ingezeten microbiota treedt op en voorkomt dat de kolonisatie door exogene bacteriën. Inderdaad, meer dan 600 soorten bacteriën in de mondholte zijn gevonden, en een enkel individu kan ongeveer 100 verschillende op elk gewenst moment uitvoeren. Mondelinge bacteriën bezitten het vermogen om te voldoen aan de verschillende niches in de mondelinge ecosysteem, dus steeds geïntegreerd binnen de ingezetene microbiële gemeenschappen, en de bevordering van de groei en de overleving. De stroom van bacteriën in de darm tijdens het slikken is echter voorgesteld om het evenwicht van de darmflora verstoord. In feite, verschoven orale toediening van P. gingivalis bacteriële samenstelling in de ileale van de darmflora. We gebruikten een synthetische Gemeenschap als een vereenvoudigde weergave van de natuurlijke orale ecosysteem, ophelderen van het voortbestaan en de levensvatbaarheid van mondelinge bacteriën aan gesimuleerde gastro-intestinale transit voorwaarden onderworpen. Veertien soorten werden geselecteerd, onderworpen aan de in vitro speeksel, maag en intestinale spijsvertering processen en gepresenteerd aan een multicompartment cel model met Caco-2 en HT29-MTX cellen ter simulering van de darm mucosal epitheel. Dit model diende te ontrafelen van de impact van slikte bacteriën op cellen die betrokken zijn bij de enterohepatische circulatie. Met behulp van synthetische gemeenschappen zorgt voor controleerbaarheid en reproduceerbaarheid. Dus, deze methode kan worden aangepast aan het beoordelen van de levensvatbaarheid van pathogenen en latere wijzigingen van de ontsteking-geassocieerde, kolonisatie capaciteit van probiotische mengsels, en uiteindelijk, potentiële bacteriële invloed op het presystemic verkeer.
Introduction
Mensen samenwonen met bacteriën, die aanwezig is op hetzelfde nummer als menselijke cellen1zijn. Vandaar, is het van cruciaal belang belangrijk te verkrijgen van een grondig inzicht in de menselijke microbiome. De mondholte is een unieke omgeving, omdat het is verdeeld in verschillende kleinere habitats, dus met een grote verscheidenheid van bacteriën en biofilms op de verschillende locaties. Wordt een open ecosysteem, kan sommige soorten in de mond worden voorbijgaande bezoekers. Echter, bepaalde micro-organismen koloniseren kort na de geboorte en vorm georganiseerd biofilms2. Deze zijn te vinden in het oppervlak van de tanden boven de gingival spleet, de subgingivale spleet, tong, mucosal oppervlakken en tandheelkundige protheses en vullingen3. Bacteriën kunnen ook aanwezig zoals Floc en planktonische cellen in het lumen van het kanaal van de tand, vermengd met necrotisch pulp weefsel of gesuspendeerd in een vloeibare fase.
Er is een actief, continu cross-talk tussen de cellen van de gastheer en de resident microbiota4. Bacteriën communiceren binnen en tussen soorten, en slechts een klein deel van de natuurlijke kolonisten kan vasthouden aan weefsels, terwijl andere bacteriën aan deze primaire kolonisten hechten. Bijvoorbeeld, is cel-cel binding tussen micro-organismen de sleutel voor mondelinge biofilms te integreren in de secundaire kolonisten, en het bouwen van complexe netwerken van interagerende Microbiële cellen-4. Ongeveer worden 70% van de bacteriële aggregaten in een steekproef van speeksel gevormd door Porphyromonas sp., Streptococcus sp., Prevotella sp., Veillonella sp. en onbekende Bacteroidetes. F. nucleatum is een tussenliggende kolonisator in de subgingivale biofilm en aggregaten met de late kolonisten P. gingivalis, T. denticola, pt Tannerella forsythia, die zijn betrokken bij parodontitis5. Streptococcus mitis neemt bovendien zowel mucosal en tandheelkundige habitats, terwijl S. sanguinis pt S. gordonii verkiezen te koloniseren tanden3. Dus is, S. sanguinis aanwezig in de onderste snijtanden en hoektanden, terwijl Actinomyces naeslundii heeft gevonden in de bovenste Anteriores6.
Bovendien, speelt de inheemse microbiome een rol bij het handhaven van de gezondheid van de mens2. Resident microbiota participeert in immuun onderwijs en bij het voorkomen van pathogen expansie. Deze kolonisatie resistentie doet zich voor omdat de inheemse bacteriën beter worden kunnen aangepast bij het aansluiten van oppervlakken en efficiënter op de metabolising van de beschikbare voedingsstoffen voor groei. Hoewel probiotische stammen de gastro-intestinale passage overleven en actief te blijven, is de persistentie van autochtone bacteriën opname door de mond van een bovenste locatie van het maag-darmstelsel niet volledig beschreven. Dus, we een kunstmatige Gemeenschap, vertegenwoordiger van het mondelinge ecosysteem, aan gesimuleerde gastro-intestinale transit voorwaarden onderworpen. Levensvatbaarheid van bacteriële cellen werd beoordeeld met behulp van een multicompartment model dat lijkt op het epitheel van de darm. Huidige gut simulatoren bieden geschikte reproduceerbaarheid in termen van analyse van de luminal van de microbiële Gemeenschap7. Echter, bacteriële hechting- en gastheer-microbe interactie worden afzonderlijk behandeld, zoals cellijnen combineren met microbiële gemeenschappen is uitdagend8. In tegenstelling, presenteren we een kader waarmee potentiële mechanistische uitleg van succesvolle kolonisatie gebeurtenissen gemeld op de gut-interface. Inderdaad, dit model kan worden samen gebruikt met een statische gut-model om te evalueren van het effect van microbiële gemeenschappen op host oppervlakte signalering.
Protocol
Representative Results
Discussion
De mondelinge microbiome is een sleutelelement in de gezondheid van de mens, zoals onlangs gerapporteerd door diverse auteurs20,21. Eerdere bevindingen suggereren dat de inname van speeksel met grote ladingen van bacteriën het microbiële ecosysteem van de dunne darm, die tot de belangrijkste sites voor immuun priming behoort kan beïnvloeden. De combinatie van een statische bovenste gastro-intestinale spijsvertering model met de host-interface vertegenwoordigd …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs mijn dankbaarheid uitspreken voor financiële steun van de Flanders Research Foundation aan Marta Calatayud Arroyo (FWO postdoctoral fellowship-12N2815N). Emma Hernandez-Sanabria is een postdoctoraal ondersteund door Vlaanderen innovatie en ondernemerschap (Agentschap voor Innovatie door Wetenschap en Technologie, IWT).
Materials
| STRAINS | |||
| Aggregatibacter actinomycetemcomitans | American Type Culture Collection | ATCC 43718 | |
| Fusobacterium nucleatum | American Type Culture Collection | ATCC 10953 | |
| Porphyromonas gingivalis | American Type Culture Collection | ATCC 33277 | |
| Prevotella intermedia | American Type Culture Collection | ATCC 25611 | |
| Streptococcus mutans | American Type Culture Collection | ATCC 25175 | |
| Streptococcus sobrinus | American Type Culture Collection | ATCC 33478 | |
| Actinomyces viscosus | American Type Culture Collection | ATCC 15987 | |
| Streptococcus salivarius TOVE-R | |||
| Streptococcus mitis | American Type Culture Collection | ATCC 49456 | |
| Streptococcus sanguinis | BCCM/LMG Bacteria Collection | LMG 14657 | |
| Veillonella parvula | Leibniz Institute DSMZ-German Collection of Microorganisms and Cell Cultures | DSM 2007 | |
| Streptococcus gordonii | American Type Culture Collection | ATCC 49818 | |
| CELL LINES | |||
| Caco-2 cells | European Collection of Authenticated Cell Cultures | 86010202 | |
| HT29-MTX cells | European Collection of Authenticated Cell Cultures | 12040401 | |
| REAGENTS AND CONSUMABLES | |||
| Brain Heart Infusion (BHI) broth | Oxoid | CM1135 | |
| Blood Agar 2 | Oxoid | CM0055 | Blood Agar medium |
| Menadione | Sigma | M9429 | |
| Hemin | Sigma | H9039 | |
| 5% sterile defibrinated horse blood | E&O Laboratories Ltd, | P030 | |
| InnuPREP PCRpure Kit | Analytik Jena | 845-KS-5010250 | PCR purification kit |
| Big Dye | Applied Biosystems | 4337454 | Dye for sequencing |
| ABI Prism BigDye Terminator v3.1 cycle sequencing kit | Applied Biosystems | 4337456 | |
| SYBR Green I | Invitrogen | S7585 | |
| Propidium Iodide | Invitrogen | P1304MP | |
| T25 culture flasks uncoated, cell-culture treated, vented, sterile | VWR | 734-2311 | |
| Trypsin-EDTA solution | Sigma-Aldrich | T3924-100ML | |
| Trypan Blue solution 0.4%, liquid, sterile-filtered |
Sigma-Aldrich | T8154 | |
| PBS | Gibco | 14190250 | |
| DMEM cell culture media, with GlutaMAX and Pyruvate | Life technologies | 31966-047 | |
| Corning Transwell polyester membrane cell culture inserts | Sigma-Aldrich | CLS3450-24EA | |
| Mucin from porcine stomach Type II | Sigma-Aldrich | M2378 | |
| Inactivated fetal bovine serum | Greiner Bio One | 758093 | |
| Antibiotic-Antimycotic (100X) | Gibco | 15240062 | |
| Triton X 100 for molecular biology | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| DPBS without calcium, magnesium | Gibco | 14190-250 | |
| Pierce LDH Cytotoxicity Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | 88953 | |
| Corning HTS Transwell-24 well, pore size 0.4 µm | Corning Costar Corp | 3450 | |
| Nuclease-free water | Serva Electrophoresis | 28539010 | |
| EQUIPMENT | |||
| Neubauer counting chamber improved | Carl Roth | T729.1 | |
| BD Accuri C6 Flow cytometer | BD Biosciences | 653118 | |
| PowerLyzer 24 Homogenizer | MoBio | 13155 | |
| T100 Thermal Cycler | BioRad | 186-1096 | |
| Flush system | Custom made | – | |
| InnOva 4080 Incubator Shaker | New Brunswick Scientific | 8261-30-1007 | Shaker for 2.10 |
| Memmert CO2 incubator | Memmert GmbH & Co. | ICO150med | |
| Millicell ERS (Electrical Resistance System) | EMD Millipore, Merck KGaA | MERS00002 | |
| Millipore Milli-Q academic, ultra pure water system | Millipore, Merck KGaA | – | |
| Shaker (ROCKER 3D basic) | IKA | 4000000 | Shaker for 6.10 |
Referências
- Sender, R., Fuchs, S., Milo, R. Revised estimates for the number of human and bacteria cells in the body. PLoS Biology. 14, e1002533 (2016).
- Kelly, D., King, T., Aminov, R. Importance of microbial colonization of the gut in early life to the development of immunity. Mutation Research-Fundamental and Molecular Mechanisms of Mutagenesis. , 58-69 (2007).
- Aas, J. A., Paster, B. J., Stokes, L. N., Olsen, I., Dewhirst, F. E. Defining the normal bacterial flora of the oral cavity. Journal of Clinical Microbiology. 43, 5721-5732 (2005).
- Marsh, P. D., Head, D. A., Devine, D. A. Dental plaque as a biofilm and a microbial community-Implications for treatment. Journal of Oral Biosciences. 57, 185-191 (2015).
- Socransky, S. S., Haffajee, A. D., Cugini, M. A., Smith, C., Kent, R. L. Microbial complexes in subgingival plaque. Journal of Clinical Periodontology. 25, 134-144 (1998).
- Haffajee, A. D., et al. Subgingival microbiota in healthy, well-maintained elder and periodontitis subjects. Journal of Clinical Periodontology. 25, 346-353 (1998).
- Venema, K. Microbial metabolites produced by the colonic microbiota as drivers for immunomodulation in the host. The FASEB Journal. 27, (2013).
- Marzorati, M., et al. The HMI (TM) module: A new tool to study the Host-Microbiota Interaction in the human gastrointestinal tract in vitro. BMC Microbiology. 14, 133 (2014).
- Tanzer, J. M., Kurasz, A. B., Clive, J. Competitive displacement of mutans streptococci and inhibition of tooth-decay by Streptococcus-Salivarius Tove-R. Infection and Immunity. 48, 44-50 (1985).
- Slomka, V., et al. Nutritional stimulation of commensal oral bacteria suppresses pathogens: the prebiotic concept. Journal of Clinical Periodontology. 44, 344-352 (2017).
- Hernandez-Sanabria, E., et al. In vitro increased respiratory activity of selected oral bacteria may explain competitive and collaborative interactions in the oral microbiome. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 7, 235 (2017).
- Alvarez, G., Gonzalez, M., Isabal, S., Blanc, V., Leon, R. Method to quantify live and dead cells in multi-species oral biofilm by real-time PCR with propidium monoazide. AMB Express. 3, (2013).
- Ehsani, E., et al. Initial evenness determines diversity and cell density dynamics in synthetic microbial ecosystems. Scientific Reports. 8, 340 (2018).
- Hernandez-Sanabria, E., et al. Correlation of particular bacterial PCR-denaturing gradient gel electrophoresis patterns with bovine ruminal fermentation parameters and feed efficiency traits. Applied and Environmental Microbiology. 76, 6338-6350 (2010).
- Masters, J. R., Stacey, G. N. Changing medium and passaging cell lines. Nature Protocols. 2, 2276-2284 (2007).
- Calatayud, M., Velez, D., Devesa, V. Metabolism of inorganic arsenic in intestinal epithelial cell lines. Chemical Research in Toxicology. 25, 2402-2411 (2012).
- Minekus, M., et al. A standardised static in vitro digestion method suitable for food – an international consensus. Food & Function. 5, 1113-1124 (2014).
- Berney, M., Hammes, F., Bosshard, F., Weilenmann, H. U., Egli, T. Assessment and interpretation of bacterial viability by using the LIVE/DEAD BacLight kit in combination with flow cytometry. Applied and Environmental Microbiology. 73, 3283-3290 (2007).
- Props, R., Monsieurs, P., Mysara, M., Clement, L., Boon, N. Measuring the biodiversity of microbial communities by flow cytometry. Methods in Ecology and Evolution. 7, 1376-1385 (2016).
- Yamashita, Y., Takeshita, T. The oral microbiome and human health. Journal of Oral Science. 59, 201-206 (2017).
- Wade, W. G. The oral microbiome in health and disease. Pharmacological Research. 69, 137-143 (2013).
- Yu, M., et al. A resource for cell line authentication, annotation and quality control. Nature. 520, 307 (2015).
- Pelaseyed, T., et al. The mucus and mucins of the goblet cells and enterocytes provide the first defense line of the gastrointestinal tract and interact with the immune system. Immunological Reviews. 260, 8-20 (2014).
- Bengoa, A. A., et al. Simulated gastrointestinal conditions increase adhesion ability of Lactobacillus paracasei strains isolated from kefir to Caco-2 cells and mucin. Food Research International. 103, 462-467 (2018).
- Kleiveland, C. R., et al., Verhoeckx, K., et al. . The Impact of Food Bioactives on Health: in vitro and ex vivo models. , 197-205 (2015).
- Laparra, J. M., Sanz, Y. Comparison of in vitro models to study bacterial adhesion to the intestinal epithelium. Letters in Applied Microbiology. 49, 695-701 (2009).
- Gagnon, M., Berner, A. Z., Chervet, N., Chassard, C., Lacroix, C. Comparison of the Caco-2, HT-29 and the mucus-secreting HT29-MTX intestinal cell models to investigate Salmonella adhesion and invasion. Journal of Microbiological Methods. 94, 274-279 (2013).
- Großkopf, T., Soyer, O. S. Synthetic microbial communities. Current Opinion in Microbiology. 18, 72-77 (2014).
