הערכת הכדאיות של קונסורציום חיידקי סינתטי על הממשק מארח-חיידק במעיים במבחנה
Summary
אינטראקציות מארח-חיידק מעיים היו העריכו באמצעות גישה מוזרה שילוב קהילה אוראלי סינתטי במבחנה במערכת העיכול עיכול, דגם של האפיתל המעי הדק. אנו מציגים שיטה שבה ניתן להתאים כדי להעריך את התא הפלישה של גורמי מחלה, biofilms מינים רב, או אפילו כדי לבדוק את השרידות של פרוביוטיקה ניסוחים.
Abstract
יחסי הגומלין בין המארח microbiota יש כבר הכיר זמן רב, בהרחבה. הפה דומה סעיפים נוספים מערכת העיכול, כפי microbiota תושב מתרחשת ומונע colonisation על ידי חיידקים אקסוגני. ואכן, נמצאו יותר מ-600 מינים של חיידקים בחלל הפה, אדם יחיד יכול לשאת סביב 100 שונים בכל עת. הפה בעל היכולת לדבוק גומחות שונים של המערכת האקולוגית אוראלי, ובכך הופכת משולב בתוך הקהילות מיקרוביאלי תושב, ואת עדיפה עם צמיחה, הישרדות. עם זאת, הזרם של חיידקים לתוך הבטן במהלך בליעה הוצע להפריע את יתרת microbiota הבטן. למעשה, אוראלי מינהל gingivalis פ מוזז קומפוזיציה חיידקי ב ileal microflora. השתמשנו קהילה סינתטיים כמו ייצוג מופשטת של המערכת האקולוגית הטבעית דרך הפה, להבהיר את הישרדות ואת הכדאיות של חיידקים אוראלי חשופים לתנאי המעבר מדומה במערכת העיכול. ארבע עשרה מינים היו שנבחרו, נתון במבחנה הרוק, קיבה, תהליכי העיכול במעיים, הציג מודל תא multicompartment המכיל תאים קאקו-2 ו- HT29-MTX להדמיית בטן האפיתל הרירית. מודל זה שימש כדי לפענח את ההשפעה של החיידקים נבלע על תאים מחזור enterohepatic. באמצעות קהילות סינטטי מאפשר בקירות וצפיות הפארמצבטית. לפיכך, מתודולוגיה זו ניתן להתאים להערכת הכדאיות הפתוגן ושינויים הבאים הקשורים לדלקת, קיבולת קולוניזציה של תערובות פרוביוטיקה, בסופו של דבר, פוטנציאל בקטריאלי להשפיע על מחזור הדם presystemic.
Introduction
בני אדם cohabit עם חיידקים, אשר נמצאים באותו מקום כמו תאים אנושיים1. לפיכך, חשוב קריטיים להשיג הבנה מקיפה microbiome האנושית. חלל הפה הוא סביבה ייחודית בכך הוא מחולק במספר בתי גידול קטן יותר, ובכך המכיל מגוון רחב של חיידקים, biofilms במיקומים שונים אלה. להיות פתוח המערכת האקולוגית, מינים מסוימים בפה יכול להיות המבקרים ארעית. עם זאת, מיקרואורגניזמים מסוימים ליישב מיד לאחר הלידה וצורת מאורגן biofilms2. אלה מצויים על פני השיניים מעל האתר חניכיים, הבקיע subgingival, הלשון, משטחים הרירית, שיניים תותבות, סתימות3. חיידקים ניתן נוכח גם כמו flocs, תאים פלנקטוניים לומן של תעלת השן, או intermixed עם רקמת נמק מוך או הושעה בשלב הנוזלים.
יש קרוס פעיל, רציף-דיבורים בין התאים המארחים את תושב microbiota4. חיידקים תקשורת בתוך ובין מינים, רק אחוז קטן של colonizers טבעי יכול לדבוק רקמות, ואילו חיידקים אחרים לצרף אלה colonizers הראשי. למשל, תא-תא איגוד בין מיקרואורגניזמים הוא מפתח עבור שילוב colonizers משני biofilms אוראלי, ובניית רשתות מורכבות של תאי חיידקים שמעצבת4. בסביבות 70% של אגרגטים חיידקי דגימת רוק בלבד נוצרות על ידי Porphyromonas sp., סטרפטוקוקוס sp., Prevotella sp., Veillonella sp. לא מזוהה Bacteroidetes. פ nucleatum הוא הקולוניאליסט ביניים subgingival biofilm, אגרגטים עם colonizers מאחר gingivalis פ, denticola ט, ו- Tannerella forsythia, אשר אינם מעורבים חניכיים5. בנוסף, סטרפטוקוקוס מיטיס תופסת בתי גידול הרירית והן שיניים, בעוד sanguinis ס ו ס gordonii מעדיפים ליישב שיניים3. לפיכך, sanguinis ס קיים החותכות והתחתון הולכי על ארבע, בעוד Actinomyces naeslundii נמצא anteriors העליון6.
בנוסף, microbiome ילידים ממלאת תפקיד בשמירה על בריאות האדם2. תושב microbiota משתתף בחינוך המערכת החיסונית, מניעת התרחבות הפתוגן. התנגדות colonisation זו מתרחשת כיוון החיידק מקורי עשוי להיות טוב יותר מתאימים הצמדת משטחים, יעיל יותר ב metabolising זמין חומרים מזינים לצמיחה. למרות זנים פרוביוטיקה לשרוד את המעבר במערכת העיכול, להישאר פעילה, התמדתו של חיידקים autochthonous בלע ממיקום העליון של מערכת העיכול לא מלא תואר. לכן, אנחנו חשופים של קהילה מלאכותית, נציג של המערכת האקולוגית אוראלי, לתנאי המעבר מדומה במערכת העיכול. הכדאיות של תאים חיידקיים הוערכה באמצעות דגם multicompartment דמוי האפיתל הבטן. סימולטורים בטן הנוכחיים מציעים הפארמצבטית מתאימים מבחינת ניתוח של הקהילה חיידקים luminal7. עם זאת, אדהזיה חיידקי ואינטראקציה מארח-חיידק בנפרד מטופלות, כמו שילוב של שורות תאים עם קהילות מיקרוביאלי הוא מאתגר8. לעומת זאת, אנו מציגים מסגרת המספקת הסבר מכניסטית פוטנציאלי של אירועים מוצלחים קולוניזציה דיווחו על הממשק בטן. אכן, מודל זה במשותף ניתן עם דגם בטן סטטי כדי להעריך את ההשפעה של קהילות חיידקים על איתות משטח המארח.
Protocol
Representative Results
Discussion
Microbiome אוראלי הוא רכיב מפתח בבריאות האדם שדווחו לאחרונה על-ידי מחברים מספר20,21. ממצאים קודמים מראים כי הבליעה של רוק המכיל המון גדול של חיידקים יכולים להשפיע על המערכת האקולוגית מיקרוביאלית של המעי הדק, אשר הוא אחד האתרים המרכזיים עבור המערכת החיסונית תחול. ה…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים להכיר בהכרת תודה התמיכה הכספית מקרן מחקר פלנדריה מרתה Calatayud ארויו (FWO פוסט-דוקטורט במלגת-12N2815N). אמה הרננדז-Sanabria הוא בחור דוקטורט הנתמך על-ידי פלנדריה חדשנות ויזמות (Agentschap voor Innovatie הדלת Wetenschap en Technologie, IWT).
Materials
| STRAINS | |||
| Aggregatibacter actinomycetemcomitans | American Type Culture Collection | ATCC 43718 | |
| Fusobacterium nucleatum | American Type Culture Collection | ATCC 10953 | |
| Porphyromonas gingivalis | American Type Culture Collection | ATCC 33277 | |
| Prevotella intermedia | American Type Culture Collection | ATCC 25611 | |
| Streptococcus mutans | American Type Culture Collection | ATCC 25175 | |
| Streptococcus sobrinus | American Type Culture Collection | ATCC 33478 | |
| Actinomyces viscosus | American Type Culture Collection | ATCC 15987 | |
| Streptococcus salivarius TOVE-R | |||
| Streptococcus mitis | American Type Culture Collection | ATCC 49456 | |
| Streptococcus sanguinis | BCCM/LMG Bacteria Collection | LMG 14657 | |
| Veillonella parvula | Leibniz Institute DSMZ-German Collection of Microorganisms and Cell Cultures | DSM 2007 | |
| Streptococcus gordonii | American Type Culture Collection | ATCC 49818 | |
| CELL LINES | |||
| Caco-2 cells | European Collection of Authenticated Cell Cultures | 86010202 | |
| HT29-MTX cells | European Collection of Authenticated Cell Cultures | 12040401 | |
| REAGENTS AND CONSUMABLES | |||
| Brain Heart Infusion (BHI) broth | Oxoid | CM1135 | |
| Blood Agar 2 | Oxoid | CM0055 | Blood Agar medium |
| Menadione | Sigma | M9429 | |
| Hemin | Sigma | H9039 | |
| 5% sterile defibrinated horse blood | E&O Laboratories Ltd, | P030 | |
| InnuPREP PCRpure Kit | Analytik Jena | 845-KS-5010250 | PCR purification kit |
| Big Dye | Applied Biosystems | 4337454 | Dye for sequencing |
| ABI Prism BigDye Terminator v3.1 cycle sequencing kit | Applied Biosystems | 4337456 | |
| SYBR Green I | Invitrogen | S7585 | |
| Propidium Iodide | Invitrogen | P1304MP | |
| T25 culture flasks uncoated, cell-culture treated, vented, sterile | VWR | 734-2311 | |
| Trypsin-EDTA solution | Sigma-Aldrich | T3924-100ML | |
| Trypan Blue solution 0.4%, liquid, sterile-filtered |
Sigma-Aldrich | T8154 | |
| PBS | Gibco | 14190250 | |
| DMEM cell culture media, with GlutaMAX and Pyruvate | Life technologies | 31966-047 | |
| Corning Transwell polyester membrane cell culture inserts | Sigma-Aldrich | CLS3450-24EA | |
| Mucin from porcine stomach Type II | Sigma-Aldrich | M2378 | |
| Inactivated fetal bovine serum | Greiner Bio One | 758093 | |
| Antibiotic-Antimycotic (100X) | Gibco | 15240062 | |
| Triton X 100 for molecular biology | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| DPBS without calcium, magnesium | Gibco | 14190-250 | |
| Pierce LDH Cytotoxicity Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | 88953 | |
| Corning HTS Transwell-24 well, pore size 0.4 µm | Corning Costar Corp | 3450 | |
| Nuclease-free water | Serva Electrophoresis | 28539010 | |
| EQUIPMENT | |||
| Neubauer counting chamber improved | Carl Roth | T729.1 | |
| BD Accuri C6 Flow cytometer | BD Biosciences | 653118 | |
| PowerLyzer 24 Homogenizer | MoBio | 13155 | |
| T100 Thermal Cycler | BioRad | 186-1096 | |
| Flush system | Custom made | – | |
| InnOva 4080 Incubator Shaker | New Brunswick Scientific | 8261-30-1007 | Shaker for 2.10 |
| Memmert CO2 incubator | Memmert GmbH & Co. | ICO150med | |
| Millicell ERS (Electrical Resistance System) | EMD Millipore, Merck KGaA | MERS00002 | |
| Millipore Milli-Q academic, ultra pure water system | Millipore, Merck KGaA | – | |
| Shaker (ROCKER 3D basic) | IKA | 4000000 | Shaker for 6.10 |
Referências
- Sender, R., Fuchs, S., Milo, R. Revised estimates for the number of human and bacteria cells in the body. PLoS Biology. 14, e1002533 (2016).
- Kelly, D., King, T., Aminov, R. Importance of microbial colonization of the gut in early life to the development of immunity. Mutation Research-Fundamental and Molecular Mechanisms of Mutagenesis. , 58-69 (2007).
- Aas, J. A., Paster, B. J., Stokes, L. N., Olsen, I., Dewhirst, F. E. Defining the normal bacterial flora of the oral cavity. Journal of Clinical Microbiology. 43, 5721-5732 (2005).
- Marsh, P. D., Head, D. A., Devine, D. A. Dental plaque as a biofilm and a microbial community-Implications for treatment. Journal of Oral Biosciences. 57, 185-191 (2015).
- Socransky, S. S., Haffajee, A. D., Cugini, M. A., Smith, C., Kent, R. L. Microbial complexes in subgingival plaque. Journal of Clinical Periodontology. 25, 134-144 (1998).
- Haffajee, A. D., et al. Subgingival microbiota in healthy, well-maintained elder and periodontitis subjects. Journal of Clinical Periodontology. 25, 346-353 (1998).
- Venema, K. Microbial metabolites produced by the colonic microbiota as drivers for immunomodulation in the host. The FASEB Journal. 27, (2013).
- Marzorati, M., et al. The HMI (TM) module: A new tool to study the Host-Microbiota Interaction in the human gastrointestinal tract in vitro. BMC Microbiology. 14, 133 (2014).
- Tanzer, J. M., Kurasz, A. B., Clive, J. Competitive displacement of mutans streptococci and inhibition of tooth-decay by Streptococcus-Salivarius Tove-R. Infection and Immunity. 48, 44-50 (1985).
- Slomka, V., et al. Nutritional stimulation of commensal oral bacteria suppresses pathogens: the prebiotic concept. Journal of Clinical Periodontology. 44, 344-352 (2017).
- Hernandez-Sanabria, E., et al. In vitro increased respiratory activity of selected oral bacteria may explain competitive and collaborative interactions in the oral microbiome. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 7, 235 (2017).
- Alvarez, G., Gonzalez, M., Isabal, S., Blanc, V., Leon, R. Method to quantify live and dead cells in multi-species oral biofilm by real-time PCR with propidium monoazide. AMB Express. 3, (2013).
- Ehsani, E., et al. Initial evenness determines diversity and cell density dynamics in synthetic microbial ecosystems. Scientific Reports. 8, 340 (2018).
- Hernandez-Sanabria, E., et al. Correlation of particular bacterial PCR-denaturing gradient gel electrophoresis patterns with bovine ruminal fermentation parameters and feed efficiency traits. Applied and Environmental Microbiology. 76, 6338-6350 (2010).
- Masters, J. R., Stacey, G. N. Changing medium and passaging cell lines. Nature Protocols. 2, 2276-2284 (2007).
- Calatayud, M., Velez, D., Devesa, V. Metabolism of inorganic arsenic in intestinal epithelial cell lines. Chemical Research in Toxicology. 25, 2402-2411 (2012).
- Minekus, M., et al. A standardised static in vitro digestion method suitable for food – an international consensus. Food & Function. 5, 1113-1124 (2014).
- Berney, M., Hammes, F., Bosshard, F., Weilenmann, H. U., Egli, T. Assessment and interpretation of bacterial viability by using the LIVE/DEAD BacLight kit in combination with flow cytometry. Applied and Environmental Microbiology. 73, 3283-3290 (2007).
- Props, R., Monsieurs, P., Mysara, M., Clement, L., Boon, N. Measuring the biodiversity of microbial communities by flow cytometry. Methods in Ecology and Evolution. 7, 1376-1385 (2016).
- Yamashita, Y., Takeshita, T. The oral microbiome and human health. Journal of Oral Science. 59, 201-206 (2017).
- Wade, W. G. The oral microbiome in health and disease. Pharmacological Research. 69, 137-143 (2013).
- Yu, M., et al. A resource for cell line authentication, annotation and quality control. Nature. 520, 307 (2015).
- Pelaseyed, T., et al. The mucus and mucins of the goblet cells and enterocytes provide the first defense line of the gastrointestinal tract and interact with the immune system. Immunological Reviews. 260, 8-20 (2014).
- Bengoa, A. A., et al. Simulated gastrointestinal conditions increase adhesion ability of Lactobacillus paracasei strains isolated from kefir to Caco-2 cells and mucin. Food Research International. 103, 462-467 (2018).
- Kleiveland, C. R., et al., Verhoeckx, K., et al. . The Impact of Food Bioactives on Health: in vitro and ex vivo models. , 197-205 (2015).
- Laparra, J. M., Sanz, Y. Comparison of in vitro models to study bacterial adhesion to the intestinal epithelium. Letters in Applied Microbiology. 49, 695-701 (2009).
- Gagnon, M., Berner, A. Z., Chervet, N., Chassard, C., Lacroix, C. Comparison of the Caco-2, HT-29 and the mucus-secreting HT29-MTX intestinal cell models to investigate Salmonella adhesion and invasion. Journal of Microbiological Methods. 94, 274-279 (2013).
- Großkopf, T., Soyer, O. S. Synthetic microbial communities. Current Opinion in Microbiology. 18, 72-77 (2014).
