Evaluar la viabilidad de un consorcio bacteriano sintético en la interfaz de Host-microbio In Vitro Gut
Summary
Interacciones de host-microbio intestinal fueron evaluadas usando un nuevo enfoque que combina una comunidad oral sintético, en vitro la digestión gastrointestinal y un modelo del epitelio del intestino delgado. Presentamos un método que puede ser adaptado para evaluar invasión celular de patógenos y biofilms multiespecies, o incluso para probar la supervivencia de las formulaciones probióticas.
Abstract
La interacción entre huésped y microbiota ha sido reconocida desde hace mucho y ampliamente descrito. La boca es similar a otras secciones del tracto gastrointestinal, como microbiota residente se produce y evita la colonización por bacterias exógenas. De hecho, más de 600 especies de bacterias se encuentran en la cavidad bucal, y una sola persona puede llevar alrededor de 100 diferentes en cualquier momento. Bacterias orales poseen la capacidad de adherirse a los diferentes nichos en el ecosistema oral, integrándose así dentro de las comunidades microbianas residente y que favorece crecimiento y supervivencia. Sin embargo, se ha propuesto el flujo de bacterias en el intestino durante la ingestión de perturbar el equilibrio de la microbiota intestinal. De hecho, la administración oral de p. gingivalis cambió de puesto la composición bacteriana en la microflora ileal. Utilizamos una comunidad sintético como una representación simplificada del ecosistema oral natural, a la supervivencia y viabilidad de bacterias orales sometidos a condiciones de tránsito gastrointestinal simulada. Catorce especies fueron seleccionadas sometidas a en vitro salival, gástrica y procesos de la digestión intestinal y presentó a un modelo de multicompartment de la célula que contiene las células Caco-2 y HT29-MTX para simular el epitelio de la mucosa intestinal. Este modelo sirve para desentrañar el impacto de bacterias ingeridas en células que participan en la circulación enterohepática. Utilizando las comunidades sintéticas permite la capacidad de control y reproducibilidad. Por lo tanto, esta metodología puede ser adaptada para evaluar viabilidad del patógeno y la subsecuentes inflamación asociados cambios, capacidad de colonización de las mezclas de probióticos, y en última instancia, bacteriana potencial impacto en la circulación presistémica.
Introduction
Los seres humanos conviven con las bacterias, que están presentes en el mismo número que las células humanas1. Por lo tanto, es de crucial importante obtener un conocimiento integral del microbioma humano. La cavidad bucal es un entorno único en que se divide en varios hábitats más pequeño, así que contiene una gran variedad de bacterias y biofilms en los diferentes lugares. Ser un ecosistema abierto, algunas especies en la boca pueden ser visitantes transitorios. Sin embargo, ciertos microorganismos colonicen pronto después de nacimiento y forma organizan de biofilms2. Estas se encuentran en la superficie de los dientes por encima de la grieta gingival, la grieta subgingival, lengüeta, superficies de la mucosa y prótesis dentales y rellenos3. Las bacterias también pueden estar presentes como flóculos y células planctónicas en el lumen del conducto del diente, entremezcladas con tejido pulpar necrótico o suspendidas en una fase fluida.
Existe una activo, continua interferencia entre las células del huésped y la microbiota residente4. Las bacterias se comunican dentro de y entre especies, y sólo una pequeña proporción de los colonizadores naturales puede adherirse a los tejidos, mientras que otras bacterias se conecte a estos colonizadores primarios. Por ejemplo, Unión célula-célula entre microorganismos es clave para la integración de colonizadores secundarios en biofilms orales y construcción de redes complejas de interacción de las células microbianas de4. Alrededor del 70% de agregados bacterianos en una muestra de saliva se forman por Porphyromonas SP., Streptococcus SP., Prevotella SP, Veillonella SP. y no identificado Bacteroidetes. F. nucleatum es un colonizador intermedio en la biopelícula subgingival y agregados con los colonizadores finales p. gingivalis, T. denticola y Tannerella forsythia, que están implicados en la periodontitis5. Además, Streptococcus mitis ocupa hábitats de mucosa y dentales, mientras que S. sanguinis y S. gordonii prefieren colonizar los dientes3. Así, S. sanguinis está presente en incisivos inferiores y caninos, mientras que el Actinomyces naeslundii se ha encontrado en dientes anteriores superiores6.
Además, lo indígenas microbioma juega un papel en el mantenimiento de la salud2. Microbiota residente participa en la educación inmune y en la prevención de la expansión de patógenos. Esta resistencia a la colonización se produce porque las bacterias nativas pueden ser mejor adaptado en la fijación a las superficies y más eficiente en metabolizar los nutrientes disponibles para el crecimiento. Aunque cepas probióticas sobreviven el paso gastrointestinal y permanecen activas, la persistencia de las bacterias autóctonas que se ingiere desde una ubicación superior del tracto gastrointestinal no se ha descrito completamente. Por lo tanto, sometimos a una comunidad artificial, representante del ecosistema oral, a las condiciones del tránsito gastrointestinal simulada. Viabilidad de las células bacterianas se evaluó mediante un modelo multicompartment que se asemeja al epitelio intestinal. Simuladores de tripa actual ofrecen reproducibilidad adecuada en términos de análisis de la comunidad microbiana luminal7. Sin embargo, adherencia bacteriana e interacción microbio host son por separado dirigidas, como la combinación de líneas celulares con comunidades microbianas es un reto8. Por el contrario, presentamos un marco que proporciona la explicación mecanicista potencial de colonización exitosa eventos registrados en la interfaz de la tripa. De hecho, este modelo puede conjuntamente utilizar con un modelo estático de la tripa para evaluar el impacto de las comunidades microbianas en señalización de superficie de host.
Protocol
Representative Results
Discussion
El microbioma oral es un elemento clave en la salud humana reportada recientemente por varios autores20,21. Los resultados anteriores sugieren que la ingestión de saliva, que contiene grandes cargas de bacterias puede influir en el ecosistema microbiano del intestino, que es uno de los sitios principales para oscurecimiento inmunológico. La combinación de un modelo de digestión gastrointestinal superior estático con la interfaz de anfitrión, representado po…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores reconocen con gratitud el apoyo financiero de la Fundación de investigación de Flandes a Marta Calatayud Arroyo (FWO postdoctoral fellowship-12N2815N). Emma Hernandez-Sanabria es una beca posdoctoral apoyada por Flandes innovación y emprendimiento (Agentschap voor innovadores puerta Wetenschap en Technologie, IWT).
Materials
| STRAINS | |||
| Aggregatibacter actinomycetemcomitans | American Type Culture Collection | ATCC 43718 | |
| Fusobacterium nucleatum | American Type Culture Collection | ATCC 10953 | |
| Porphyromonas gingivalis | American Type Culture Collection | ATCC 33277 | |
| Prevotella intermedia | American Type Culture Collection | ATCC 25611 | |
| Streptococcus mutans | American Type Culture Collection | ATCC 25175 | |
| Streptococcus sobrinus | American Type Culture Collection | ATCC 33478 | |
| Actinomyces viscosus | American Type Culture Collection | ATCC 15987 | |
| Streptococcus salivarius TOVE-R | |||
| Streptococcus mitis | American Type Culture Collection | ATCC 49456 | |
| Streptococcus sanguinis | BCCM/LMG Bacteria Collection | LMG 14657 | |
| Veillonella parvula | Leibniz Institute DSMZ-German Collection of Microorganisms and Cell Cultures | DSM 2007 | |
| Streptococcus gordonii | American Type Culture Collection | ATCC 49818 | |
| CELL LINES | |||
| Caco-2 cells | European Collection of Authenticated Cell Cultures | 86010202 | |
| HT29-MTX cells | European Collection of Authenticated Cell Cultures | 12040401 | |
| REAGENTS AND CONSUMABLES | |||
| Brain Heart Infusion (BHI) broth | Oxoid | CM1135 | |
| Blood Agar 2 | Oxoid | CM0055 | Blood Agar medium |
| Menadione | Sigma | M9429 | |
| Hemin | Sigma | H9039 | |
| 5% sterile defibrinated horse blood | E&O Laboratories Ltd, | P030 | |
| InnuPREP PCRpure Kit | Analytik Jena | 845-KS-5010250 | PCR purification kit |
| Big Dye | Applied Biosystems | 4337454 | Dye for sequencing |
| ABI Prism BigDye Terminator v3.1 cycle sequencing kit | Applied Biosystems | 4337456 | |
| SYBR Green I | Invitrogen | S7585 | |
| Propidium Iodide | Invitrogen | P1304MP | |
| T25 culture flasks uncoated, cell-culture treated, vented, sterile | VWR | 734-2311 | |
| Trypsin-EDTA solution | Sigma-Aldrich | T3924-100ML | |
| Trypan Blue solution 0.4%, liquid, sterile-filtered |
Sigma-Aldrich | T8154 | |
| PBS | Gibco | 14190250 | |
| DMEM cell culture media, with GlutaMAX and Pyruvate | Life technologies | 31966-047 | |
| Corning Transwell polyester membrane cell culture inserts | Sigma-Aldrich | CLS3450-24EA | |
| Mucin from porcine stomach Type II | Sigma-Aldrich | M2378 | |
| Inactivated fetal bovine serum | Greiner Bio One | 758093 | |
| Antibiotic-Antimycotic (100X) | Gibco | 15240062 | |
| Triton X 100 for molecular biology | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| DPBS without calcium, magnesium | Gibco | 14190-250 | |
| Pierce LDH Cytotoxicity Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | 88953 | |
| Corning HTS Transwell-24 well, pore size 0.4 µm | Corning Costar Corp | 3450 | |
| Nuclease-free water | Serva Electrophoresis | 28539010 | |
| EQUIPMENT | |||
| Neubauer counting chamber improved | Carl Roth | T729.1 | |
| BD Accuri C6 Flow cytometer | BD Biosciences | 653118 | |
| PowerLyzer 24 Homogenizer | MoBio | 13155 | |
| T100 Thermal Cycler | BioRad | 186-1096 | |
| Flush system | Custom made | – | |
| InnOva 4080 Incubator Shaker | New Brunswick Scientific | 8261-30-1007 | Shaker for 2.10 |
| Memmert CO2 incubator | Memmert GmbH & Co. | ICO150med | |
| Millicell ERS (Electrical Resistance System) | EMD Millipore, Merck KGaA | MERS00002 | |
| Millipore Milli-Q academic, ultra pure water system | Millipore, Merck KGaA | – | |
| Shaker (ROCKER 3D basic) | IKA | 4000000 | Shaker for 6.10 |
Referências
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