Beregningsmæssige analyse af Caenorhabditis elegans kønscelleoverførsel at studere Distribution kerner, proteiner og cytoskelettet
Summary
Vi præsenterer en automatiseret metode for tre-dimensionelle genopbygning af Caenorhabditis elegans kønscelleoverførsel. Vores metode bestemmer antallet og placeringen af hver kerne inden for kønscelleoverførsel og analyser kønscelleoverførsel protein fordeling og cytoskeletal struktur.
Abstract
Caenorhabditis elegans (C. elegans) kønscelleoverførsel bruges til at studere adskillige biologisk vigtige processer herunder stamceller udvikling, apoptose og kromosom dynamics. Mens germline er en fremragende model, er analysen ofte to dimensionelle på grund af tid og arbejdskraft nødvendige for tre-dimensionelle analyse. Store udlæsninger i sådanne undersøgelser er nummeret/placeringen af kerner og protein fordeling i germline. Vi præsenterer her, en metode til at udføre automatiseret analyse af genom ved hjælp af Konfokal mikroskopi og beregningsmæssige metoder til at bestemme antallet og placeringen af kerner i hver region af germline. Vores metode analyserer også kønscelleoverførsel protein fordeling, der gør det muligt for de tre-dimensionelle undersøgelse af protein udtryk i forskellige genetiske baggrunde. Yderligere, vores undersøgelse viser variationer i cytoskeletal arkitektur i forskellige regioner af de germline, der kan rumme specifikke rumlige udviklingsmæssige krav. Endelig, vores metode muliggør automatisk optælling af sæd i spermatheca af hver kønscelleoverførsel. Tilsammen, vores metode giver mulighed for hurtig og reproducerbare fænotypiske analyser af C. elegans kønscelleoverførsel.
Introduction
Bevarelse af signalering veje med pattedyr gør C. elegans en fremragende model til at studere flere biologiske processer1,2. I vores laboratorium bruger vi C. elegans kønscelleoverførsel at studere stamcelle udvikling, apoptose og genekspression. Mens germline er en tredimensionel struktur, er mange undersøgelser to dimensionelle følge af tre-dimensionelle analyse tidskrævende og arbejdskrævende. Det er meget sandsynligt, at to-dimensionelle analyse kan forvanske i vivo begivenheder i germline. C. elegans voksen hermafrodit har to kønscelleoverførsel arme, hver især huser en somatisk distale tip celle (DTC), der fastholder distale kønsceller i en udifferentieret tilstand3,4. Disse kimceller begynde at skelne, når de bevæger sig væk fra DTC, undslippe sin indflydelse, og bliver æg og sæd når de når den proksimale ende af germline. Under denne proces gennemgå kønscelle kerner mitose, før du skifter til meiose5,6. Sperm produktion er afsluttet af larve fase 4 (L4) af udvikling, hvorefter oocyter er produceret i løbet af voksenlivet. Sædceller er gemt i spermatheca hvor de befrugte oocytter til at generere embryoner.
Der er flere genetiske og miljømæssige faktorer, der kan have indflydelse på genom udvikling i C. elegans resulterer i ændringer i antallet af kerner, antal apoptotiske begivenheder, kromosom dynamics, og protein udtryk og/eller lokalisering7 ,8,9,10,11. Analysen af disse begivenheder kræver identifikation af hver enkelt fase af differentiering baseret på nuklear morfologi og distribution. For præcist at analysere disse parametre manuelt med en stor stikprøve er arbejdskrævende og tidskrævende. At omgå disse ulemper og aktivere konsekvens af analyse, vi udviklede en automatiseret metode for tre-dimensionelle undersøgelse af C. elegans kønscelleoverførsel for kerner optælling, kerner distribution, protein udtryk, og cytoskeletal struktur. Ved at kombinere konfokalmikroskopi med tre-dimensionelle gengivelse, genereret vi størrelsen og formen parametre til identifikation af hver enkelt fase af kønscelle differentiering. Yderligere, denne metode giver mulighed for optælling af kønscelle kerner og sæd plus scoring af kromosomtal i hver oocyt.
En afgørende struktur i germline er cytoskeleton, som giver stabilitet til kønscelleoverførsel rum, aids cytoplasmatisk streaming og beskyttelse til kønscelleoverførsel kerner12. Bruger beregningsmæssige rendering, vi udført tre-dimensionelle genopbygning af germline cytoskelettet og identificeres særskilt cytoskeletal funktioner inden for germline. Her, beskriver vi en trinvis protokol for at illustrere hvordan beregningsmæssige analyse kombineret med Konfokal imaging giver omfattende analyse af C. elegans kønscelleoverførsel.
Vi foreslår en hurtig metode til tre-dimensionelle analyse af C. elegans kønscelleoverførsel (figur 1). Med tre-dimensionelle analyse, er det muligt at studere tredimensionale distribution af kønscelleoverførsel kerner (figur 2 og figur 3), automatiseret tælling af celler (figur 2), genopbygning af germline cytoskelettet ( Figur 3), fordeling af proteiner (figur 4), og han scorede antallet af sædceller i spermatheca og kromosomer i oocyter (figur 5). Metoden, der ikke kun giver mulighed for nem og præcis kvantificering af germline men identificerer fysiologisk relevante fænotyper.
Protocol
Representative Results
Discussion
Målet med denne protokol er at forbedre nøjagtigheden og reducere den tid, der kræves for kønscelleoverførsel analyse. Efter standardpraeparat af dissekerede germlines, er en tre-dimensionelle model af kønscelleoverførsel kerner udarbejdet af computational rendering. Samtidig giver mulighed for observation af kønscelleoverførsel kerner fordeling i rummet, beregner tre-dimensionelle gengivelse antallet af kerner på bestemte områder af germline. Den kritiske aspekt af vores metode er nøjagtig definition af stø…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker Monash Microimaging for deres tekniske support. Nogle stammer blev leveret af Caenorhabditis genetik Center, som er finansieret af NIH Office for forskning infrastruktur programmer (P40 OD010440). Dette arbejde blev støttet af en Monash Universitet biomedicin Discovery Fellowship, NHMRC Project Grant (GNT1105374), NHMRC Senior Research Fellowship (GNT1137645) og veski innovation fellowship: VIF 23 til Roger Pocock.
Materials
| C. elegans strains: wild type (N2, Bristol), rnp-8(tm2435) I/hT2[bli-4(e937) let-?(q782) qIs48] (I;III), cpb-3(bt17) I, glp-1 (e2141) III | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | ||
| OP50 Escherichia coli bacteria | Homemade | ||
| Nematode Growth Media (NGM) plates | Homemade | ||
| polyclonal rabbit anti-REC-8 | SDIX | 29470002 | |
| Alexa 488 conjugated antibody raised in goat | Thermofisher Scientific | A-21236 | |
| Cytoskeletal dye phalloidin | Thermofisher Scientific | A-12380 | |
| DAPI | Thermofisher Scientific | 62248 | |
| Poly-L-lysine | Sigma Aldrich | P5899 | |
| Tetramisol | Sigma Aldrich | P5899 | |
| MgSO4 | Sigma Aldrich | M7506 | |
| 1M HEPES buffer, pH 7.4 | Sigma Aldrich | G0887 | |
| 10X PBS pH 7.4 | Thermofisher Scientific | AM9625 | |
| Tween-20 | Sigma Aldrich | P1389 | |
| EGTA | Sigma Aldrich | E3889 | |
| 37% Paraformaldehyde solution | Merck Millipore | 1040031000 | |
| Normal goat serum | Sigma Aldrich | G9023 | |
| Fluoroshield fixing reagent | Sigma Aldrich | F6182 | |
| Ethanol | Millipore | 1009832511 | |
| Methanol | Sigma Aldrich | 34860 | |
| 20°C & 25°CIncubator | Any brand | ||
| Light microscope | Any brand | ||
| Confocal microscope | Any brand (Leica, Zeiss) | ||
| Computer equipped with Imaris suit 8.4.1 or later version, full licence to use the software and Matlab software. | Bitplane | ||
| Phospho buffered saline, pH 7.4 | Homemade | ||
| Teflon microscope slides | Tekdon | 941-322-8288 |
Referências
- Hubbard, E. J. Caenorhabditis elegans germ line: a model for stem cell biology. Dev Dyn. 236 (12), 3343-3357 (2007).
- Joshi, P. M., Riddle, M. R., Djabrayan, N. J., Rothman, J. H. Caenorhabditis elegans as a model for stem cell biology. Dev Dyn. 239 (5), 1539-1554 (2010).
- Kershner, A., et al. Germline stem cells and their regulation in the nematode Caenorhabditis elegans. Adv Exp Med Biol. 786, 29-46 (2013).
- Byrd, D. T., Knobel, K., Affeldt, K., Crittenden, S. L., Kimble, J. A DTC niche plexus surrounds the germline stem cell pool in Caenorhabditis elegans. PLoS One. 9 (2), 88372 (2014).
- Kimble, J., Crittenden, S. L. Controls of germline stem cells, entry into meiosis, and the sperm/oocyte decision in Caenorhabditis elegans. Annu Rev Cell Dev Biol. 23, 405-433 (2007).
- Hansen, D., Hubbard, E. J., Schedl, T. Multi-pathway control of the proliferation versus meiotic development decision in the Caenorhabditis elegans germline. Dev Biol. 268 (2), 342-357 (2004).
- Crittenden, S. L., et al. A conserved RNA-binding protein controls germline stem cells in Caenorhabditis elegans. Nature. 417 (6889), 660-663 (2002).
- Eckmann, C. R., Crittenden, S. L., Suh, N., Kimble, J. GLD-3 and control of the mitosis/meiosis decision in the germline of Caenorhabditis elegans. Genética. 168 (1), 147-160 (2004).
- Schumacher, B., et al. Translational repression of C. elegans p53 by GLD-1 regulates DNA damage-induced apoptosis. Cell. 120 (3), 357-368 (2005).
- McMullen, P. D., et al. Macro-level modeling of the response of C. elegans reproduction to chronic heat stress. PLoS Comput Biol. 8 (1), 1002338 (2012).
- Hubbard, E. J., Korta, D. Z., Dalfo, D. Physiological control of germline development. Adv Exp Med Biol. 757, 101-131 (2013).
- Wolke, U., Jezuit, E. A., Priess, J. R. Actin-dependent cytoplasmic streaming in C. elegans oogenesis. Development. 134 (12), 2227-2236 (2007).
- Jones, A. R., Francis, R., Schedl, T. GLD-1, a cytoplasmic protein essential for oocyte differentiation, shows stage- and sex-specific expression during Caenorhabditis elegans germline development. Dev Biol. 180 (1), 165-183 (1996).
- Hasegawa, E., Karashima, T., Sumiyoshi, E., Yamamoto, M. C. elegans CPB-3 interacts with DAZ-1 and functions in multiple steps of germline development. Dev Biol. 295 (2), 689-699 (2006).
- Austin, J., Kimble, J. glp-1 is required in the germ line for regulation of the decision between mitosis and meiosis in C. elegans. Cell. 51 (4), 589-599 (1987).
- Berry, L. W., Westlund, B., Schedl, T. Germ-line tumor formation caused by activation of glp-1, a Caenorhabditis elegans member of the Notch family of receptors. Development. 124 (4), 925-936 (1997).
- Fox, P. M., Schedl, T. Analysis of Germline Stem Cell Differentiation Following Loss of GLP-1 Notch Activity in Caenorhabditis elegans. Genética. 201 (1), 167-184 (2015).
- Pasierbek, P., et al. A Caenorhabditis elegans cohesion protein with functions in meiotic chromosome pairing and disjunction. Genes and Development. 15 (11), 1349-1360 (2001).
- Klass, M., Wolf, N., Hirsh, D. Development of the male reproductive system and sexual transformation in the nematode Caenorhabditis elegans. Dev Biol. 52 (1), 1-18 (1976).
- Korta, D. Z., Tuck, S., Hubbard, E. J. S6K links cell fate, cell cycle and nutrient response in C. elegans germline stem/progenitor cells. Development. 139 (5), 859-870 (2012).
- Laband, K., et al. Chromosome segregation occurs by microtubule pushing in oocytes. Nat Commun. 8 (1), 1499 (2017).
