Вычислительный анализ микрофлорой Caenorhabditis elegans для изучения распределения ядер, белки и Цитоскелет
Summary
Мы представляем автоматизированный метод для трехмерной реконструкции Caenorhabditis elegans микрофлорой. Наш метод определяет количество и положение каждого ядра в микрофлорой и анализ распределения белка микрофлорой и цитоскелета структуру.
Abstract
Caenorhabditis elegans (C. elegans) микрофлорой используется для изучения нескольких биологически важные процессы, включая динамики развития, апоптоз и хромосомы стволовых клеток. В то время как микрофлорой является прекрасной моделью, анализ часто является двух измерениях благодаря времени и труда, необходимых для трехмерного анализа. Основные надписи в такие исследования являются положение/число ядер и белка распределения в рамках микрофлорой. Здесь мы представляем метод для выполнения автоматизированного анализа микрофлорой, используя confocal микроскопии и вычислительных подходов для определения количество и положение ядер в каждом регионе микрофлорой. Наш метод также анализирует распределение белка микрофлорой, который позволяет трехмерной изучение экспрессии белков в различных генетических стола. Кроме того наше исследование показывает вариации в цитоскелета архитектуры в отдельных регионах микрофлорой, который может вместить требованиями пространственного развития. Наконец наш метод позволяет автоматического подсчета спермы в сперматека каждого микрофлорой. Взятые вместе, наш метод позволяет быстрое и воспроизводимые фенотипические анализ C. elegans микрофлорой.
Introduction
Сохранению сигнальные пути с mammals делает C. elegans отличную модель для изучения нескольких биологических процессов1,2. В нашей лаборатории мы используем микрофлорой C. elegans для изучения развития стволовых клеток, апоптоз и экспрессии генов. В то время как микрофлорой трехмерную структуру, многие исследования являются двумя размерные связи с длительным и трудоемким характером трехмерного анализа. Это весьма вероятно, что двумерный анализ может искажать в vivo события в микрофлорой. Взрослый гермафродита C. elegans имеет две руки микрофлорой, каждая из которых дома соматических дистального наконечника клеток (DTC), которая поддерживает дистальной клетки семенозачатка в недифференцированных государства3,4. Эти клетки семенозачатка начинают различать как они движутся от MS DTC, избежать его влияния и стать яйцеклеток и сперматозоидов, как они достигают проксимальный конец микрофлорой. В ходе этого процесса ядра зародышевых клеток проходят митоз, перед переходом к мейоз5,6. Производство спермы дополняется личиночной стадии 4 (L4) разработки, после чего ооциты производятся во взрослом возрасте. Сперматозоиды хранятся в сперматека, где они оплодотворить яйцеклетки для создания эмбрионов.
Существует несколько генетических и экологических факторов, которые могут влиять на развитие микрофлорой в C. elegans повлекло изменения в количество ядер, количество apoptotic события, хромосома динамики и выражение протеина или локализации7 ,8,9,10,11. Анализ этих событий требует идентификации каждого этапа дифференциация, основанная на ядерное Словотолкование и распределения. Чтобы точно анализировать эти параметры вручную с большой выборки является трудоемким и длительным. Чтобы обойти эти недостатки и включить последовательность анализа, мы разработали автоматизированный метод для трехмерных экспертизы микрофлорой C. elegans для подсчета ядер, распределение ядер, выражение протеина и цитоскелета структура. Объединив конфокальная микроскопия с трехмерной визуализации, мы создали параметры размера и формы для идентификации каждой стадии дифференцировки клеток зародыша. Кроме того этот метод позволяет подсчета ядра зародышевых клеток и спермы плюс озвучивание число хромосом в каждой ооцитов.
Один из важнейших структура в микрофлорой является цитоскелета, который обеспечивает стабильность микрофлорой отсека, СПИД цитоплазматических потокового и защиту микрофлорой ядер12. Использование компьютерной визуализации, мы выступали трехмерной реконструкции цитоскелета микрофлорой и выявленных особенностей цитоскелета внутри микрофлорой. Здесь мы опишем пошаговое протокол для иллюстрации как Вычислительный анализ в сочетании с конфокальный изображений включает всесторонний анализ C. elegans микрофлорой.
Мы предлагаем быстрый метод для трехмерного анализа C. elegans микрофлорой (рис. 1). Использование трехмерного анализа, это возможно для изучения трехмерной распределение ядер микрофлорой (рис. 2 и рис. 3), автоматизированные подсчет клеток (рис. 2), реконструкция микрофлорой цитоскелета ( Рисунок 3), распределение белков (рис. 4) и забил количество спермы в сперматека и хромосом яйцеклетки (рис. 5). Метод не только позволяет легко и точная количественная оценка микрофлорой, но идентифицирует физиологически соответствующих фенотипов.
Protocol
Representative Results
Discussion
Цель настоящего Протокола заключается в улучшить точность и сократить время, необходимое для анализа микрофлорой. После стандартной подготовки расчлененных germlines трехмерную модель микрофлорой ядер подготовленный компьютерной визуализации. Позволяя наблюдения пространственного ра?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим Monash Microimaging за их техническую поддержку. Некоторые штаммы были предоставлены центром генетики Caenorhabditis , который финансируется Управлением NIH инфраструктуры научно-исследовательских программ (P40 OD010440). Эта работа была поддержана Монаш Университета биомедицины Discovery Стипендия, Грант проекта NHMRC (GNT1105374), NHMRC старший стипендий (GNT1137645) и Вески инноваций стипендий: 23 ВИФ-Роджер Покок.
Materials
| C. elegans strains: wild type (N2, Bristol), rnp-8(tm2435) I/hT2[bli-4(e937) let-?(q782) qIs48] (I;III), cpb-3(bt17) I, glp-1 (e2141) III | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | ||
| OP50 Escherichia coli bacteria | Homemade | ||
| Nematode Growth Media (NGM) plates | Homemade | ||
| polyclonal rabbit anti-REC-8 | SDIX | 29470002 | |
| Alexa 488 conjugated antibody raised in goat | Thermofisher Scientific | A-21236 | |
| Cytoskeletal dye phalloidin | Thermofisher Scientific | A-12380 | |
| DAPI | Thermofisher Scientific | 62248 | |
| Poly-L-lysine | Sigma Aldrich | P5899 | |
| Tetramisol | Sigma Aldrich | P5899 | |
| MgSO4 | Sigma Aldrich | M7506 | |
| 1M HEPES buffer, pH 7.4 | Sigma Aldrich | G0887 | |
| 10X PBS pH 7.4 | Thermofisher Scientific | AM9625 | |
| Tween-20 | Sigma Aldrich | P1389 | |
| EGTA | Sigma Aldrich | E3889 | |
| 37% Paraformaldehyde solution | Merck Millipore | 1040031000 | |
| Normal goat serum | Sigma Aldrich | G9023 | |
| Fluoroshield fixing reagent | Sigma Aldrich | F6182 | |
| Ethanol | Millipore | 1009832511 | |
| Methanol | Sigma Aldrich | 34860 | |
| 20°C & 25°CIncubator | Any brand | ||
| Light microscope | Any brand | ||
| Confocal microscope | Any brand (Leica, Zeiss) | ||
| Computer equipped with Imaris suit 8.4.1 or later version, full licence to use the software and Matlab software. | Bitplane | ||
| Phospho buffered saline, pH 7.4 | Homemade | ||
| Teflon microscope slides | Tekdon | 941-322-8288 |
Referências
- Hubbard, E. J. Caenorhabditis elegans germ line: a model for stem cell biology. Dev Dyn. 236 (12), 3343-3357 (2007).
- Joshi, P. M., Riddle, M. R., Djabrayan, N. J., Rothman, J. H. Caenorhabditis elegans as a model for stem cell biology. Dev Dyn. 239 (5), 1539-1554 (2010).
- Kershner, A., et al. Germline stem cells and their regulation in the nematode Caenorhabditis elegans. Adv Exp Med Biol. 786, 29-46 (2013).
- Byrd, D. T., Knobel, K., Affeldt, K., Crittenden, S. L., Kimble, J. A DTC niche plexus surrounds the germline stem cell pool in Caenorhabditis elegans. PLoS One. 9 (2), 88372 (2014).
- Kimble, J., Crittenden, S. L. Controls of germline stem cells, entry into meiosis, and the sperm/oocyte decision in Caenorhabditis elegans. Annu Rev Cell Dev Biol. 23, 405-433 (2007).
- Hansen, D., Hubbard, E. J., Schedl, T. Multi-pathway control of the proliferation versus meiotic development decision in the Caenorhabditis elegans germline. Dev Biol. 268 (2), 342-357 (2004).
- Crittenden, S. L., et al. A conserved RNA-binding protein controls germline stem cells in Caenorhabditis elegans. Nature. 417 (6889), 660-663 (2002).
- Eckmann, C. R., Crittenden, S. L., Suh, N., Kimble, J. GLD-3 and control of the mitosis/meiosis decision in the germline of Caenorhabditis elegans. Genética. 168 (1), 147-160 (2004).
- Schumacher, B., et al. Translational repression of C. elegans p53 by GLD-1 regulates DNA damage-induced apoptosis. Cell. 120 (3), 357-368 (2005).
- McMullen, P. D., et al. Macro-level modeling of the response of C. elegans reproduction to chronic heat stress. PLoS Comput Biol. 8 (1), 1002338 (2012).
- Hubbard, E. J., Korta, D. Z., Dalfo, D. Physiological control of germline development. Adv Exp Med Biol. 757, 101-131 (2013).
- Wolke, U., Jezuit, E. A., Priess, J. R. Actin-dependent cytoplasmic streaming in C. elegans oogenesis. Development. 134 (12), 2227-2236 (2007).
- Jones, A. R., Francis, R., Schedl, T. GLD-1, a cytoplasmic protein essential for oocyte differentiation, shows stage- and sex-specific expression during Caenorhabditis elegans germline development. Dev Biol. 180 (1), 165-183 (1996).
- Hasegawa, E., Karashima, T., Sumiyoshi, E., Yamamoto, M. C. elegans CPB-3 interacts with DAZ-1 and functions in multiple steps of germline development. Dev Biol. 295 (2), 689-699 (2006).
- Austin, J., Kimble, J. glp-1 is required in the germ line for regulation of the decision between mitosis and meiosis in C. elegans. Cell. 51 (4), 589-599 (1987).
- Berry, L. W., Westlund, B., Schedl, T. Germ-line tumor formation caused by activation of glp-1, a Caenorhabditis elegans member of the Notch family of receptors. Development. 124 (4), 925-936 (1997).
- Fox, P. M., Schedl, T. Analysis of Germline Stem Cell Differentiation Following Loss of GLP-1 Notch Activity in Caenorhabditis elegans. Genética. 201 (1), 167-184 (2015).
- Pasierbek, P., et al. A Caenorhabditis elegans cohesion protein with functions in meiotic chromosome pairing and disjunction. Genes and Development. 15 (11), 1349-1360 (2001).
- Klass, M., Wolf, N., Hirsh, D. Development of the male reproductive system and sexual transformation in the nematode Caenorhabditis elegans. Dev Biol. 52 (1), 1-18 (1976).
- Korta, D. Z., Tuck, S., Hubbard, E. J. S6K links cell fate, cell cycle and nutrient response in C. elegans germline stem/progenitor cells. Development. 139 (5), 859-870 (2012).
- Laband, K., et al. Chromosome segregation occurs by microtubule pushing in oocytes. Nat Commun. 8 (1), 1499 (2017).
