一种基于液滴的单链 dna 放大术和微球 pcr 扩增法

Summary

本工作为液滴基微流体平台的制备和聚丙烯酰胺微球在微球 pcr 扩增中的应用提供了一种方法。微球 pcr 方法可以在不分离双链 dna 的情况下获得单链 dna 扩增器。

Abstract

液滴基微流体能够在微流体通道中可靠地生产均匀的微球, 从而提供所获得的微球的控制大小和形态。成功地制备了一种与丙烯酸-dna 探针共聚的微球。不同的方法, 如不对称 pcr, 外切酶消化, 和隔离条纹包覆磁珠可以用来合成单链 dna (ssdna)。然而, 这些方法不能有效地使用大量高度纯化的 ssdna。在这里, 我们描述了一个微球 pcr 协议, 详细介绍了如何通过从 pcr 反应管中移液来有效地扩增和分离 ssdna。ssdna 的扩增可作为 dna 微阵列和 dna-selex (通过指数富集的配体系统演化) 过程的潜在试剂。

Introduction

单链 dna (ssdna) 由于其 dna-dna 杂交 1^,2 的固有特性, 被广泛认为是一种分子识别^元素(mre)。ssdna 合成系统的发展可导致生物应用, 如 dna 微阵列³、寡糖学、诊断和基于互补相互作用^4,5的综合分子传感。

迄今为止, 微尺度聚合物颗粒已成功地使用微流体器件进行了演示。在微通道环境^6、7中, 几种微流体技术已被证明是在连续流动上产生高度均匀微球的强大技术。

在李等人的研究中.⁸、基于液滴的微流体平台, 用于共聚寡微球的微流体合成和 ssdna 扩增。微流体平台由两个 pdms (聚二甲基硅氧烷) 层组成: 一个上部具有用于产生微球的微流体通道网络和一个底部平面部分。其中包括三种 pdms 流体通道: 1) 用于液滴生成的流聚焦通道, 2) 混合两个溶液的蛇形通道, 以及 3) 用于微球凝固的连续聚合通道。一旦两个不混溶的流被引入到一个单一的 pdms 流体通道中, 这些流就可以通过狭窄的孔口结构来强制。通道几何形状、流速和粘度等流动行为影响微球的大小和形态。因此, 主流可分为^微尺度^{单圈9、10.}

本文提供了一种详细的微球 pcr 扩增方法。首先, 介绍了一种基于液滴的微流体器件的设计过程。然后, 阐述了用随机 dna 模板互补化聚丙烯酰胺微球的方法。最后, 给出了一种扩增 ssdna 的微球 pcr 协议。

Protocol

1. pdms 微流体平台的制作 采用体积比为10:1 的基础聚合物和催化剂制备20毫升液体 pdms 预聚物。将液体 pdms 的10毫升倒在微流体网络上部的硅片上制备的 su-8 模具上。对于底部扁平部分, 在没有模具结构的硅片上倒入相同体积的液体 pdms。注: 微流体网络是在 cad 程序中设计的, 然后转换为光刻机, 以便使用典型的光刻工艺制造母版 (参见补充数字)。这位大师是由硅片11上的负光?…

Representative Results

基于聚合物液滴的微流体平台由两个 pdms 层组成 (图 1a)。三种微流体通道网络用于产生微球: 1) 流动聚焦几何, 如图 1b所示, 2) 用于混合溶液 i 和溶液 ii 的蛇形通道, 3) 微球聚合通道凝固。所有通道的高度为60微米。混合和聚合的通道长度分别为74.35 毫米和94.45 毫米。两个不混溶流体流动的微通道宽度和矿物油流动的微通道宽度?…

Discussion

dsdna 的污染物是 ssdna 扩增中的一个主要问题。在传统的不对称 pcr 扩增中, 仍然很难将 dsdna 扩增降至^最低。此外, 尽管生成 ssdna 的技术改进使我们能够提高样品吞吐量的效率, 但由于其成本高、纯化产量不完整, ssdna 分离仍然存在问题。

不对称 pcr 是处理 ssdna 时最具挑战性的方法之一。这种方法应用不等数量的引物 (例如, 20:1 比率), 以产生大量的 ssdna?…

Materials

liquid polydimethylsiloxane, PDMS	Dow Corning Inc.	Sylgard 184	Components of chip
40% Acrylamide:bis solution (19:1)	Bio-rad	1610140	Components of Copolymerizable oligo-microsphere
Ammonium persulfate, APS	Sigma Aldrich	A3678	Hardener of acrylamide:bis solution
N,N,N′,N′-Tetramethylethylenediamine, TEMED	Sigma Aldrich	T9281	Catalyst of ammonium persulfate
Mineral oil	Sigma Aldrich	M5904	Table 1. Solution III. Component of microsphere reagents
Cy3 labeled complementary oligonucleotide probes	Bioneer	synthesized	Table 3. Sequence information
ssDNA acrydite labeled probe	Bioneer	synthesized	Table 1. Solution I. Component of microsphere reagents
Tris	Biosesang	T1016	Components of TE buffer, pH buffer solution
EDTA	Sigma Aldrich	EDS	Components of TE buffer, removal of ion (Ca2+)
Ex taq	Takara	RR001A	ssDNA amplification
Confocal microscope	Carl Zeiss	LSM 510	Identifying oligonucleotides expossure of microsphere surface
Light Microscope	Nikon Instruments Inc.	eclipse 80i	Caculating number of microspheres
T100 Thermal Cycler	Bio-rad	1861096	ssDNA amplification
Hand-held Corona Treater	Electro-Technic	BD-20AC Laboratory Corona Treater	Hydrophilic surface treatment
Hot plate	As one	HI-1000	heating plate for curing of liquid PDMS
Syringe pump	kd Scientific	78-1100	Uniform flow of Solution I and Solution II
Compressor	Kohands	KC-250A	Flow control of Solution III
Bright-Line Hemacytometer	Sigma Aldrich	Z359629	Caculating number of microspheres