Ein Tröpfchen mikrofluidischen Ansatz und Mikrosphären-PCR Verstärkung für Single-Stranded DNA-Amplifikate
Summary
Diese Arbeit stellt eine Methode für die Herstellung von mikrofluidischen Droplet-basierten Plattformen und die Anwendung von Polyacrylamid Mikrosphären für Mikrosphären-PCR Verstärkung. Die Mikrosphären-PCR-Methode ermöglicht es, einzelsträngigen DNA-Amplifikate ohne Trennung doppelsträngige DNA zu erhalten.
Abstract
Tröpfchen-basierte Mikrofluidik ermöglichen die zuverlässige Herstellung von homogenen Mikrosphären in den mikrofluidischen Kanal, Bereitstellung von kontrollierten Größe und Morphologie der erhaltenen Mikrosphären. Eine Mikrosphären copolymerisiert mit einer Acrydite-DNA-Sonde wurde erfolgreich hergestellt. Verschiedene Methoden wie asymmetrische PCR Exonuclease Verdauung und Isolation auf magnetische Beads Streptavidin beschichteten einsetzbar, einzelsträngiger DNA (SsDNA) zu synthetisieren. Jedoch verwenden nicht diese Methoden effizient große Mengen an hochgereinigtes SsDNA. Hier beschreiben wir eine Mikrosphären-PCR-Protokoll Details wie SsDNA effizient verstärkt und einfach durch Pipettieren von einer PCR-Reaktion-Röhre von DsDNA getrennt werden kann. Die Verstärkung der SsDNA kann als potenzielle Reagenzien für die DNA-Microarray und DNA-SELEX (systematische Evolution von Liganden durch exponentielle Anreicherung) Prozesse angewendet werden.
Introduction
Einzelsträngiger DNA (SsDNA) wurde ausgiebig als molekulare Erkennung Element (MRE) aufgrund seiner intrinsischen Eigenschaften für DNA-DNA Hybridisierung1,2berücksichtigt. Die Entwicklung von SsDNA synthetischer Systeme führt zu biologischen Anwendungen wie DNA-Microarrays3, Oligotherapeutics, Diagnostik und integrierte molekulare Erkennung basiert auf komplementäre Interaktionen4,5.
Bisher wurden erfolgreich Mikrometer-Skala Polymerpartikel mit mikrofluidischen Geräten demonstriert. Verschiedene Techniken der mikrofluidischen nachweislich um zu mächtig für die Herstellung von sehr homogene Mikrosphären auf kontinuierlichen Flow in der Microchannel Umwelt6,7.
In der Studie von Lee Et al. 8, eine Tröpfchen-basierte Mikrofluidik Plattform für Mikrofluidik-Synthese von copolymerizable Oligo-Mikrosphären und SsDNA Verstärkung wurde berichtet. Die mikrofluidischen Plattform besteht aus zwei PDMS (Polydimethylsiloxan) Schichten: einem oberen Teil mit einem Mikrofluidik-Channel-Netzwerk zur Erzeugung von Mikrosphären und einem unteren flachen Teil. Diese bestehen aus drei Arten von PDMS fluidische Kanäle: 1) einen Fluss mit Schwerpunkt Kanal für Tröpfchen Generation, (2) eine serpentine Kanal für das Mischen von zwei Lösungen und (3) eine sequenzielle Polymerisation Kanal für Mikrosphären Erstarrung. Sobald zwei nicht mischbare fließt in einen einzigen PDMS fluidische Kanal eingeführt werden, können die Ströme durch die schmale Öffnung Struktur erzwungen werden. Die Strömung Verhaltensweisen wie Kanalgeometrie, Durchfluss und Viskosität beeinflussen die Größe und Morphologie der Mikrosphären. Daher kann Microscale Monospheres9,10der Hauptstrom flüssigen unterteilt werden.
Hier ist eine detaillierte Mikrosphären-PCR-Protokoll für die Verstärkung der SsDNA zur Verfügung gestellt. Zunächst wird ein Droplet-basierte Mikrofluidik-Gerät-Design-Prozess beschrieben. Dann wird die Art und Weise, in welcher, die Polyacrylamid Mikrosphären mit zufälligen DNA Schablone komplementär funktionalisiert werden können, erklärt. Schließlich ist ein Mikrosphären-PCR-Protokoll zur Verstärkung SsDNA gezeigt.
Protocol
Representative Results
Discussion
Verunreinigungen der DsDNA sind ein wichtiges Thema in SsDNA Verstärkung. Es bleibt schwierig, DsDNA Verstärkung in herkömmlichen asymmetrischen PCR Verstärkung15zu minimieren. Obwohl technische Verbesserungen für die Erzeugung von SsDNA uns zur Steigerung der Effizienz der Probendurchsatz aktiviert haben, ist darüber hinaus SsDNA Isolation aufgrund seiner hohen Kosten und unvollständige Reinigung Erträge nach wie vor problematisch.
Asymmetrische PCR ist eine de…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Studie stützt sich auf ein Projekt mit dem Titel “kooperatives Forschungsprogramm für Agrarwissenschaft und Technologieentwicklung (Projekt Nr. PJ0011642) “finanziert durch die ländliche Entwicklung Verwaltung, Republik Korea. Diese Forschung wurde auch zum Teil durch einen Zuschuss (NRF-2017R1A2B4012253) des Basic Science Research Program durch die National Research Foundation (NRF) finanziert durch das Ministerium für Wissenschaft, ICT & Zukunft planen, Republik Korea unterstützt. Diese Forschung wurde auch durch einen Zuschuss (N0000717) des Bildungsprogramm für kreative und industrielle Konvergenz gefördert durch das Ministerium für Handel, Industrie und Energie, Republik Korea unterstützt.
Materials
| liquid polydimethylsiloxane, PDMS | Dow Corning Inc. | Sylgard 184 | Components of chip |
| 40% Acrylamide:bis solution (19:1) | Bio-rad | 1610140 | Components of Copolymerizable oligo-microsphere |
| Ammonium persulfate, APS | Sigma Aldrich | A3678 | Hardener of acrylamide:bis solution |
| N,N,N′,N′-Tetramethylethylenediamine, TEMED | Sigma Aldrich | T9281 | Catalyst of ammonium persulfate |
| Mineral oil | Sigma Aldrich | M5904 | Table 1. Solution III. Component of microsphere reagents |
| Cy3 labeled complementary oligonucleotide probes | Bioneer | synthesized | Table 3. Sequence information |
| ssDNA acrydite labeled probe | Bioneer | synthesized | Table 1. Solution I. Component of microsphere reagents |
| Tris | Biosesang | T1016 | Components of TE buffer, pH buffer solution |
| EDTA | Sigma Aldrich | EDS | Components of TE buffer, removal of ion (Ca2+) |
| Ex taq | Takara | RR001A | ssDNA amplification |
| Confocal microscope | Carl Zeiss | LSM 510 | Identifying oligonucleotides expossure of microsphere surface |
| Light Microscope | Nikon Instruments Inc. | eclipse 80i | Caculating number of microspheres |
| T100 Thermal Cycler | Bio-rad | 1861096 | ssDNA amplification |
| Hand-held Corona Treater | Electro-Technic | BD-20AC Laboratory Corona Treater | Hydrophilic surface treatment |
| Hot plate | As one | HI-1000 | heating plate for curing of liquid PDMS |
| Syringe pump | kd Scientific | 78-1100 | Uniform flow of Solution I and Solution II |
| Compressor | Kohands | KC-250A | Flow control of Solution III |
| Bright-Line Hemacytometer | Sigma Aldrich | Z359629 | Caculating number of microspheres |
Referências
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