גישה Microfluidic המבוססות על Droplet ו ננו-ספירה-PCR הגברה עבור חד גדילי DNA Amplicons
Summary
עבודה זו מספקת שיטה הזיוף של פלטפורמות מבוססות-droplet microfluidic לבין היישום של microspheres לזיהוי עבור הגברה ננו-ספירה-PCR. שיטת ננו-ספירה-PCR מאפשר לקבל חד גדילי DNA amplicons מבלי המפריד בין שני גדילי ה-DNA.
Abstract
מיקרופלואידיקה מבוסס-droplet מאפשרים ייצור אמין microspheres הומוגנית בערוץ microfluidic, מתן הגודל מבוקרת של המורפולוגיה של ננו-ספירה שהושג. ננו-ספירה copolymerized עם בדיקה acrydite-DNA היה מפוברק בהצלחה. ניתן להשתמש בשיטות שונות כגון PCR אסימטרי, עיכול אקסונוקלאז, בידוד על מצופים streptavidin beads מגנטי לסנתז DNA חד-גדילי (ssDNA). עם זאת, שיטות אלה לא ניתן להשתמש ביעילות כמויות גדולות של ssDNA נקיים במיוחד. כאן, אנו מתארים ננו-ספירה-PCR פרוטוקול המפרט איך ssDNA יכול להיות ביעילות מוגבר, הופרדו dsDNA פשוט על-ידי pipetting של צינורית תגובת ה-PCR. ההגברה של ssDNA יכול להיות מיושם כמו ריאגנטים פוטנציאליים עבור DNA microarray ותהליכים (שיטתית האבולוציה של ליגנדים על ידי העשרת מעריכית) דנ א-SELEX.
Introduction
דנ א חד גדילי (ssDNA) בהרחבה נחשב כרכיב הכרה מולקולרית (MRE) בשל תכונותיו מהותי עבור ה-DNA-DNA הכלאה1,2. פיתוח מערכות סינתטי ssDNA יכול להוביל יישומים ביולוגיים כגון ה-DNA מיקרו-מערכים3, oligotherapeutics, אבחון משולב חישה מולקולרי המבוסס על אינטראקציות משלימים4,5.
עד כה, חלקיקי הפולימר בקנה מידה מיקרומטר בהצלחה הוכחו באמצעות מכשירי microfluidic. מספר טכניקות microfluidic הוכחו להיות חזק להפקת microspheres מאוד הומוגנית על זרימה רציפה ב6,הסביבה microchannel7.
במחקר של Lee. et al. 8, פלטפורמה מבוססת-droplet microfluidic לסינתזה microfluidic של הגברה oligo-ננו-ספירה, ssDNA copolymerizable, דווח. פלטפורמת microfluidic מורכב שתי שכבות PDMS (polydimethylsiloxane): חלק עליון עם רשת ערוץ microfluidic ליצירת ננו-ספירה ו תחתון חלק שטוח. הבאנדש שלושה סוגים של ערוצי fluidic PDMS: 1) זרם התמקדות ערוץ לדור droplet 2) ערוץ סרפנטין לערבוב שני פתרונות, 3) ערוץ הפילמור רציפים התמצקות ננו-ספירה. לאחר שני זורם immiscible הם הציגו לתוך ערוץ fluidic PDMS אחד, שאפשר להכריח את הזורם דרך מבנה צר דיזה. ההתנהגויות זרימה כגון ערוץ גאומטריה, קצב הזרימה צמיגות להשפיע על הגודל ועל מורפולוגיה של ננו-ספירה. לכן, ניתן לחלק לזרם המרכזי נוזלי microscale monospheres9,10.
. הנה, ננו-ספירה מפורט-PCR פרוטוקול מסופק עבור ההגברה של ssDNA. ראשית, מתואר תהליך עיצוב של התקן מבוסס-droplet microfluidic. לאחר מכן, הדרך באילו לזיהוי microspheres יכול להיות functionalized עם תבנית ה-DNA אקראית באופן משלים הוא הסביר. לבסוף, מוצג עבור הגברה ssDNA פרוטוקול ננו-ספירה-PCR.
Protocol
Representative Results
Discussion
מזהמים של dsDNA הם נושא מרכזי ב- ssDNA הגברה. זה נשאר קשה למזער את dsDNA הגברה קונבנציונאלי אסימטרי PCR הגברה15. בנוסף, למרות שיפורים טכניים ליצירת ssDNA אפשרו לנו להגדיל את היעילות של תפוקה של הדוגמה, בידוד ssDNA הוא עדיין בעייתי בשל העלויות הגבוהות שלה טיהור לא שלם לקידומם.
PCR …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
מחקר זה נתמך על ידי פרוייקט שכותרתו “קואופרטיב תכנית המחקר עבור חקלאות מדע & טכנולוגיה פיתוח (פרויקט מס ‘ PJ0011642) “ממומן על ידי המינהל לפיתוח כפרי, הרפובליקה של קוריאה. מחקר זה נתמכה גם בחלקו על ידי מענק (ה-NRF-2017R1A2B4012253) של התוכנית מחקר מדעי בסיסי דרך לאומי מחקר קרן (ב- NRF) במימון של משרד המדע, ICT ותכנון העתיד, הרפובליקה של קוריאה. מחקר זה גם נתמך על ידי מענק (N0000717) של התוכנית לחינוך עבור מדמין והתכנסות תעשייתי ממומן על ידי משרד המסחר, התעשייה, האנרגיה, הרפובליקה של קוריאה.
Materials
| liquid polydimethylsiloxane, PDMS | Dow Corning Inc. | Sylgard 184 | Components of chip |
| 40% Acrylamide:bis solution (19:1) | Bio-rad | 1610140 | Components of Copolymerizable oligo-microsphere |
| Ammonium persulfate, APS | Sigma Aldrich | A3678 | Hardener of acrylamide:bis solution |
| N,N,N′,N′-Tetramethylethylenediamine, TEMED | Sigma Aldrich | T9281 | Catalyst of ammonium persulfate |
| Mineral oil | Sigma Aldrich | M5904 | Table 1. Solution III. Component of microsphere reagents |
| Cy3 labeled complementary oligonucleotide probes | Bioneer | synthesized | Table 3. Sequence information |
| ssDNA acrydite labeled probe | Bioneer | synthesized | Table 1. Solution I. Component of microsphere reagents |
| Tris | Biosesang | T1016 | Components of TE buffer, pH buffer solution |
| EDTA | Sigma Aldrich | EDS | Components of TE buffer, removal of ion (Ca2+) |
| Ex taq | Takara | RR001A | ssDNA amplification |
| Confocal microscope | Carl Zeiss | LSM 510 | Identifying oligonucleotides expossure of microsphere surface |
| Light Microscope | Nikon Instruments Inc. | eclipse 80i | Caculating number of microspheres |
| T100 Thermal Cycler | Bio-rad | 1861096 | ssDNA amplification |
| Hand-held Corona Treater | Electro-Technic | BD-20AC Laboratory Corona Treater | Hydrophilic surface treatment |
| Hot plate | As one | HI-1000 | heating plate for curing of liquid PDMS |
| Syringe pump | kd Scientific | 78-1100 | Uniform flow of Solution I and Solution II |
| Compressor | Kohands | KC-250A | Flow control of Solution III |
| Bright-Line Hemacytometer | Sigma Aldrich | Z359629 | Caculating number of microspheres |
Referências
- Smith, A. J. The use of exonuclease III for preparing single stranded DNA for use as a template in the chain terminator sequencing method. Nucleic Acids Research. 6 (3), 831-848 (1979).
- Sekhon, S. S., et al. Aptabody-aptatope interactions in aptablotting assays. Nanoscale. 9 (22), 7464-7475 (2017).
- Ng, J. K., Ajikumar, P. K., Stephanopoulos, G., Too, H. P. Profiling RNA polymerase-promoter interaction by using ssDNA-dsDNA probe on a surface addressable microarray. Chembiochem. 8 (14), 1667-1670 (2007).
- Sekhon, S. S., et al. Defining the copper binding aptamotif and aptamer integrated recovery platform (AIRP). Nanoscale. 9 (8), 2883-2894 (2017).
- Mikhailov, V. S., Bogenhagen, D. F. Effects of Xenopus laevis mitochondrial single-stranded DNA-binding protein on primer-template binding and 3′–>5′ exonuclease activity of DNA polymerase gamma. Journal of Biological Chemistry. 271 (31), 18939-18946 (1996).
- Yu, X., Cheng, G., Zhou, M. D., Zheng, S. Y. On-demand one-step synthesis of monodisperse functional polymeric microspheres with droplet microfluidics. Langmuir. 31 (13), 3982-3992 (2015).
- Akamatsu, K., Kanasugi, S., Nakao, S., Weitz, D. A. Membrane-Integrated Glass Capillary Device for Preparing Small-Sized Water-in-Oil-in-Water Emulsion Droplets. Langmuir. 31 (25), 7166-7172 (2015).
- Lee, S. H., et al. On-Flow Synthesis of Co-Polymerizable Oligo-Microspheres and Application in ssDNA Amplification. PLoS One. 11 (7), e0159777 (2016).
- Anna, S. L., Bontoux, N. B., Stone, H. A. Formation of dispersions using "flow focusing" in microchannels. Applied Physics Letters. 82 (3), 364-366 (2003).
- Gupta, A., Matharoo, H. S., Makkar, D., Kumar, R. Droplet formation via squeezing mechanism in a microfluidic flow-focusing device. Computers & Fluids. 100, 218-226 (2014).
- McDonald, J. C., Whitesides, G. M. Poly(dimethylsiloxane) as a material for fabricating microfluidic devices. Accounts of Chemical Research. 35 (7), 491-499 (2002).
- Haubert, K., Drier, T., Beebe, D. PDMS bonding by means of a portable, low-cost corona system. Lab on a Chip. 6 (12), 1548-1549 (2006).
- Olsen, T. R., et al. Integrated Microfluidic Selex Using Free Solution Electrokinetics. Journal of the Electrochemical Society. 164 (5), B3122-B3129 (2017).
- Dorris, D. R., et al. Oligodeoxyribonucleotide probe accessibility on a three-dimensional DNA microarray surface and the effect of hybridization time on the accuracy of expression ratios. BMC Biotechnology. 3, 6 (2003).
- Heiat, M., Ranjbar, R., Latifi, A. M., Rasaee, M. J., Farnoosh, G. Essential strategies to optimize asymmetric PCR conditions as a reliable method to generate large amount of ssDNA aptamers. Biotechnology and Applied Biochemistry. 64 (4), 541-548 (2017).
