En dråpe Microfluidic tilnærming og Microsphere PCR forsterkning for Single-strandet DNA Amplicons
Summary
Dette arbeidet gir en metode for fabrikasjon av droplet-baserte microfluidic plattformer og anvendelse av polyakrylamid mikrosfærer for microsphere PCR forsterkning. Microsphere PCR-metoden gjør det mulig å få enkelt-strandet DNA amplicons uten skille double-strandet DNA.
Abstract
Slippverktøy-baserte microfluidics gjør at pålitelig produksjonen av homogen mikrosfærer i mikrovæskekanalen, kontrollert størrelse og morfologi av innhentet microsphere. En microsphere copolymerized med en acrydite-DNA sonde ble vellykket fabrikkert. Metoder som asymmetrisk PCR, exonuclease fordøyelsen og isolasjon på streptavidin-belagt magnetiske perler kan brukes å syntetisere single-strandet DNA (ssDNA). Men kan ikke disse metodene effektivt bruke store mengder høyrenset ssDNA. Her beskriver vi en microsphere PCR protokoll detaljering hvordan ssDNA kan være effektivt forsterket og atskilt fra dsDNA ved pipettering fra et PCR reaksjon rør. Forsterkningen på ssDNA kan brukes som potensielle reagenser for DNA microarray og DNA-SELEX (systematisk utviklingen av ligander av eksponentiell berikelse) prosesser.
Introduction
Single-strandet DNA (ssDNA) har vært grundig vurdert som et molekylær anerkjennelse element (MRE) på grunn av dens iboende egenskaper for DNA-DNA hybridisering1,2. Utviklingen av ssDNA syntetiske systemer kan føre til biologiske programmer som DNA microarrays3, oligotherapeutics, diagnostikk og integrert molekylær sensing basert på supplerende interaksjoner4,5.
Hittil har mikrometer skala polymer partikler blitt vist med microfluidic enheter. Flere microfluidic teknikker har vist seg for å være kraftig for å produsere svært homogen mikrosfærer på kontinuerlig flyt i microchannel miljø6,7.
I studiet av Lee et al. 8, en dråpe-baserte microfluidic plattform for microfluidic syntese av copolymerizable oligo-microsphere og ssDNA forsterkning ble rapportert. Den microfluidic består av to PDMS (polydimethylsiloxane) lag: en øvre del med et microfluidic kanal nettverk for å generere microsphere og en bunn flatt del. Disse består av tre typer PDMS fluidic kanaler: 1) en flyt fokusere kanal for slippverktøy generasjon, 2) en serpentin kanal for å blande to løsninger og 3) en sekvensiell polymerisasjon kanal for microsphere størkning. Når to ikke blandbar flyter innføres i én PDMS fluidic kanal, kan strømmer bli tvunget gjennom smale orifice strukturen. Flyt atferd som kanal geometri, vannmengde og viskositet påvirke størrelsen på og morfologi av microsphere. Derfor kan main flytende stream deles inn i Mikroskala monospheres9,10.
Her tilbys en detaljert microsphere PCR-protokoll for forsterkningen på ssDNA. Først er en dråpe-baserte microfluidic enheten designprosessen beskrevet. Deretter er veien i hvilke polyakrylamid mikrosfærer kan være functionalized med tilfeldige DNA mal på en utfyllende måte forklart. Til slutt vises en microsphere PCR-protokoll for å forsterke ssDNA.
Protocol
Representative Results
Discussion
Forurensning av dsDNA er et stort problem i ssDNA forsterkning. Det er fortsatt vanskelig å minimere dsDNA forsterkning i konvensjonelle asymmetrisk PCR forsterkning15. Dessuten, selv om tekniske forbedringer for å generere ssDNA har aktivert til å øke effektiviteten av utvalg ytelse, er ssDNA isolasjon fortsatt problematisk på grunn av sin høye kostnader og ufullstendig rensing gir.
Asymmetrisk PCR er en av de mest utfordrende metodene under arbeid med ssDNA. Den…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denne studien er støttet av et prosjekt kalt “kooperativ Research Program for landbruk vitenskap og teknologiutvikling (Project nr. PJ0011642) “finansiert av Rural Development administrasjonen, Sør-Korea. Denne forskningen ble delvis støttet av stipend (NRF-2017R1A2B4012253) av grunnleggende vitenskap forskningsprogrammet gjennom National Research Foundation (NRF) finansiert av departementet for vitenskap, IKT og fremtiden planlegging, Sør-Korea. Denne forskningen ble også støttet av stipend (N0000717) av programmet utdanning for Creative og industrielle konvergens finansiert av departementet for handel og industri energi, Sør-Korea.
Materials
| liquid polydimethylsiloxane, PDMS | Dow Corning Inc. | Sylgard 184 | Components of chip |
| 40% Acrylamide:bis solution (19:1) | Bio-rad | 1610140 | Components of Copolymerizable oligo-microsphere |
| Ammonium persulfate, APS | Sigma Aldrich | A3678 | Hardener of acrylamide:bis solution |
| N,N,N′,N′-Tetramethylethylenediamine, TEMED | Sigma Aldrich | T9281 | Catalyst of ammonium persulfate |
| Mineral oil | Sigma Aldrich | M5904 | Table 1. Solution III. Component of microsphere reagents |
| Cy3 labeled complementary oligonucleotide probes | Bioneer | synthesized | Table 3. Sequence information |
| ssDNA acrydite labeled probe | Bioneer | synthesized | Table 1. Solution I. Component of microsphere reagents |
| Tris | Biosesang | T1016 | Components of TE buffer, pH buffer solution |
| EDTA | Sigma Aldrich | EDS | Components of TE buffer, removal of ion (Ca2+) |
| Ex taq | Takara | RR001A | ssDNA amplification |
| Confocal microscope | Carl Zeiss | LSM 510 | Identifying oligonucleotides expossure of microsphere surface |
| Light Microscope | Nikon Instruments Inc. | eclipse 80i | Caculating number of microspheres |
| T100 Thermal Cycler | Bio-rad | 1861096 | ssDNA amplification |
| Hand-held Corona Treater | Electro-Technic | BD-20AC Laboratory Corona Treater | Hydrophilic surface treatment |
| Hot plate | As one | HI-1000 | heating plate for curing of liquid PDMS |
| Syringe pump | kd Scientific | 78-1100 | Uniform flow of Solution I and Solution II |
| Compressor | Kohands | KC-250A | Flow control of Solution III |
| Bright-Line Hemacytometer | Sigma Aldrich | Z359629 | Caculating number of microspheres |
Referências
- Smith, A. J. The use of exonuclease III for preparing single stranded DNA for use as a template in the chain terminator sequencing method. Nucleic Acids Research. 6 (3), 831-848 (1979).
- Sekhon, S. S., et al. Aptabody-aptatope interactions in aptablotting assays. Nanoscale. 9 (22), 7464-7475 (2017).
- Ng, J. K., Ajikumar, P. K., Stephanopoulos, G., Too, H. P. Profiling RNA polymerase-promoter interaction by using ssDNA-dsDNA probe on a surface addressable microarray. Chembiochem. 8 (14), 1667-1670 (2007).
- Sekhon, S. S., et al. Defining the copper binding aptamotif and aptamer integrated recovery platform (AIRP). Nanoscale. 9 (8), 2883-2894 (2017).
- Mikhailov, V. S., Bogenhagen, D. F. Effects of Xenopus laevis mitochondrial single-stranded DNA-binding protein on primer-template binding and 3′–>5′ exonuclease activity of DNA polymerase gamma. Journal of Biological Chemistry. 271 (31), 18939-18946 (1996).
- Yu, X., Cheng, G., Zhou, M. D., Zheng, S. Y. On-demand one-step synthesis of monodisperse functional polymeric microspheres with droplet microfluidics. Langmuir. 31 (13), 3982-3992 (2015).
- Akamatsu, K., Kanasugi, S., Nakao, S., Weitz, D. A. Membrane-Integrated Glass Capillary Device for Preparing Small-Sized Water-in-Oil-in-Water Emulsion Droplets. Langmuir. 31 (25), 7166-7172 (2015).
- Lee, S. H., et al. On-Flow Synthesis of Co-Polymerizable Oligo-Microspheres and Application in ssDNA Amplification. PLoS One. 11 (7), e0159777 (2016).
- Anna, S. L., Bontoux, N. B., Stone, H. A. Formation of dispersions using "flow focusing" in microchannels. Applied Physics Letters. 82 (3), 364-366 (2003).
- Gupta, A., Matharoo, H. S., Makkar, D., Kumar, R. Droplet formation via squeezing mechanism in a microfluidic flow-focusing device. Computers & Fluids. 100, 218-226 (2014).
- McDonald, J. C., Whitesides, G. M. Poly(dimethylsiloxane) as a material for fabricating microfluidic devices. Accounts of Chemical Research. 35 (7), 491-499 (2002).
- Haubert, K., Drier, T., Beebe, D. PDMS bonding by means of a portable, low-cost corona system. Lab on a Chip. 6 (12), 1548-1549 (2006).
- Olsen, T. R., et al. Integrated Microfluidic Selex Using Free Solution Electrokinetics. Journal of the Electrochemical Society. 164 (5), B3122-B3129 (2017).
- Dorris, D. R., et al. Oligodeoxyribonucleotide probe accessibility on a three-dimensional DNA microarray surface and the effect of hybridization time on the accuracy of expression ratios. BMC Biotechnology. 3, 6 (2003).
- Heiat, M., Ranjbar, R., Latifi, A. M., Rasaee, M. J., Farnoosh, G. Essential strategies to optimize asymmetric PCR conditions as a reliable method to generate large amount of ssDNA aptamers. Biotechnology and Applied Biochemistry. 64 (4), 541-548 (2017).
