Uma abordagem Microfluidic gotículas e amplificação por PCR-microesfera para Single-Stranded DNA Amplicons
Summary
Este trabalho fornece um método para a fabricação de plataformas baseadas em gotículas microfluidic e a aplicação de microesferas de poliacrilamida para amplificação por PCR-microesfera. O método de PCR-microesfera torna possível obter single-stranded DNA amplicons sem separar o DNA de cadeia dupla.
Abstract
Baseado em gotículas microfluídica permite a produção confiável de microesferas homogêneas no canal microfluídicos, fornecendo controlado tamanho e morfologia da microesfera obtida. Uma microesfera copolymerized com uma sonda de acrydite-DNA foi fabricada com sucesso. Diferentes métodos como PCR, digestão do exonuclease e isolamento em grânulos magnéticos streptavidin-revestido assimétrica podem ser usados para sintetizar o DNA de cadeia simples (ssDNA). No entanto, estes métodos eficientemente não utilizam grandes quantidades de ssDNA altamente purificado. Aqui, descrevemos um protocolo de microesfera-PCR detalhando como ssDNA pode ser eficientemente amplificado e separado do dsDNA simplesmente por pipetagem de um tubo de reação de PCR. A amplificação do ssDNA pode ser aplicada como reagentes potenciais para a DNA microarray e processos de DNA-SELEX (evolução sistemática dos ligantes por enriquecimento exponencial).
Introduction
Single-stranded DNA (ssDNA) tem sido amplamente considerado como um elemento de reconhecimento molecular (ERM) devido a suas propriedades intrínsecas para hibridação de DNA-DNA1,2. O desenvolvimento de sistemas sintéticos ssDNA pode levar a aplicações biológicas, tais como o DNA microarrays3, oligotherapeutics, diagnóstico e detecção molecular integrada com base em interações complementares4,5.
Até à data, as partículas de polímero do micrômetro-escala tem sido com sucesso demonstradas usando dispositivos microfluídicos. Várias técnicas de microfluidic tem sido provadas para ser poderoso para produzir altamente homogêneas microesferas em fluxo contínuo no ambiente microchannel6,7.
No estudo de Lee et al . 8, uma plataforma baseada em gotículas microfluidic para a síntese de microfluidic de amplificação oligo-microesfera e ssDNA copolymerizable foi relatado. A plataforma microfluidic consiste de duas camadas PDMS (polidimetilsiloxano): uma parte superior com uma rede de canais microfluídicos para gerar microesfera e um parte plana de fundo. Estes consistem de três tipos de canais fluídico PDMS: 1) um fluxo de focagem canal para geração de gotículas, 2) é um canal de serpentino para misturar as duas soluções e 3) um canal de polimerização sequencial para solidificação de microesfera. Uma vez que dois fluxos imiscíveis são introduzidos em um único canal PDMS fluídico, os fluxos podem ser forçados através da estrutura de orifício estreito. Os comportamentos de fluxo como geometria do canal, taxa de fluxo e viscosidade afetam o tamanho e morfologia da microesfera. Portanto, o principal fluxo de líquido pode ser dividido em microescala monospheres9,10.
Aqui, um protocolo detalhado microesfera-PCR é fornecido para a amplificação do ssDNA. Em primeiro lugar, um processo de design do dispositivo baseado em gotículas microfluidic é descrito. Então, a maneira na qual poliacrilamida microesferas podem ser acrescidas com modelo de DNA aleatório de modo complementar, é explicada. Finalmente, um protocolo de microesfera-PCR para amplificação ssDNA é mostrado.
Protocol
Representative Results
Discussion
Contaminantes de dsDNA são um grande problema no ssDNA amplificação. Continua a ser difícil minimizar dsDNA amplificação em PCR amplificação assimétrica convencional15. Além disso, apesar de melhorias técnicas para gerar ssDNA permitiram-na aumentar a eficiência da taxa de transferência de amostra, ssDNA isolamento ainda é problemático devido a seus elevados custos e rendimentos de purificação incompleta.
PCR assimétrico é um dos métodos mais desafia…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este estudo é apoiado por um projeto intitulado “cooperativa programa de pesquisa para agricultura Science & Technology Development (projeto n. º PJ0011642) “financiado pela administração do Desenvolvimento Rural, República da Coreia. Esta pesquisa foi também parcialmente suportada por um fundo (NRF-2017R1A2B4012253), do programa de pesquisa de ciência básica através da Fundação Nacional pesquisa (NRF), financiado pelo Ministério da ciência, TIC & planejamento futuro, República da Coreia. Esta pesquisa também foi apoiada por uma bolsa (N0000717) do programa de educação para criativo e convergência industriais financiados pelo Ministério do comércio, indústria e energia, República da Coreia.
Materials
| liquid polydimethylsiloxane, PDMS | Dow Corning Inc. | Sylgard 184 | Components of chip |
| 40% Acrylamide:bis solution (19:1) | Bio-rad | 1610140 | Components of Copolymerizable oligo-microsphere |
| Ammonium persulfate, APS | Sigma Aldrich | A3678 | Hardener of acrylamide:bis solution |
| N,N,N′,N′-Tetramethylethylenediamine, TEMED | Sigma Aldrich | T9281 | Catalyst of ammonium persulfate |
| Mineral oil | Sigma Aldrich | M5904 | Table 1. Solution III. Component of microsphere reagents |
| Cy3 labeled complementary oligonucleotide probes | Bioneer | synthesized | Table 3. Sequence information |
| ssDNA acrydite labeled probe | Bioneer | synthesized | Table 1. Solution I. Component of microsphere reagents |
| Tris | Biosesang | T1016 | Components of TE buffer, pH buffer solution |
| EDTA | Sigma Aldrich | EDS | Components of TE buffer, removal of ion (Ca2+) |
| Ex taq | Takara | RR001A | ssDNA amplification |
| Confocal microscope | Carl Zeiss | LSM 510 | Identifying oligonucleotides expossure of microsphere surface |
| Light Microscope | Nikon Instruments Inc. | eclipse 80i | Caculating number of microspheres |
| T100 Thermal Cycler | Bio-rad | 1861096 | ssDNA amplification |
| Hand-held Corona Treater | Electro-Technic | BD-20AC Laboratory Corona Treater | Hydrophilic surface treatment |
| Hot plate | As one | HI-1000 | heating plate for curing of liquid PDMS |
| Syringe pump | kd Scientific | 78-1100 | Uniform flow of Solution I and Solution II |
| Compressor | Kohands | KC-250A | Flow control of Solution III |
| Bright-Line Hemacytometer | Sigma Aldrich | Z359629 | Caculating number of microspheres |
Referências
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