Vi præsenterer en protokol for antimikrobiel karakterisering af avancerede materialer. Her, den antimikrobielle aktivitet på materielle overflader er målt ved hjælp af to metoder, der supplerer hinanden: den ene er baseret på agar disk diffusion test, og den anden er en standard procedure baseret på ISO 22196:2007 norm.
Udvikling af nye avancerede materialer med forbedrede egenskaber bliver mere og mere vigtigt i en bred vifte af bioteknologiske applikationer. Således er mange roman biomaterialer er designet til at efterligne specifikke miljøer kræves for biomedicinske anvendelser som vævsmanipulering og kontrolleret medicinafgivelse. Udviklingen af materialer med forbedrede egenskaber til immobilisering af celler eller enzymer er også en nuværende forskningsemne i bioproces engineering. En af de mest ønskværdige egenskaber et materiale i disse programmer er imidlertid antimikrobiel kapacitet til at undgå eventuelle uønskede infektioner. For dette præsenterer vi let at følge protokoller for antimikrobiel karakterisering af materialer baseret på (i) agar disk diffusion testen (diffusion metode) og (ii) ISO 22196:2007-normen at måle den antimikrobielle aktivitet på materielle overflader (kontakt metode). Denne protokol skal udføres ved hjælp af Gram-positive og Gram-negative bakterier og gær til at dække en bred vifte af mikroorganismer. Som et eksempel, er 4 materialer med forskellige kemiske naturer testet efter denne protokol mod Staphylococcus aureus, Escherichia coliog Candida albicans. Resultaterne af disse test udstiller ikke-antimikrobielle aktivitet for det første materiale og øge antibakterielle aktivitet mod Gram-positive og Gram-negative bakterier til andre 3 materialer. Men ingen af de 4 materialer er stand til at hæmme væksten af Candida albicans.
Implantatet fiasko er ofte en følge af mikrobielle infektioner, der opstår trods antimikrobiel profylakse og aseptisk arbejdsvilkår. Dette problem er forårsager høj sundhedspleje omkostninger og foruroligende blandt patienter1. Vigtige bakterier som Staphylococcus aureus i øjeblikket anses for at være meget farlige patogener i nosokomielle infektioner forbundet med katetre og andre medicinske implantater og er de vigtigste forurenende stoffer af medicinske instrumenter2. Udviklingen af nye antimikrobielle strategier er derfor bydende nødvendigt for både daglige og medicinske anvendelser.
Antimikrobielle stoffer omfatter antibiotika3, kvaternære ammoniumforbindelser4, metaloxider ioner5og antimikrobielle peptider (AMP’er)6. Antibiotika efterhånden mindre effektive på grund af bakteriel resistens7, som er stigende på grund af antibiotika overforbrug8. Kvaternære ammoniumforbindelser er kun meget effektive for en kortvarig brug på grund af mikrobiel resistens9. Metaloxider ioner har længe været udnyttet som meget effektiv antimikrobielle stoffer og bruges i mange almindelige kommercielle produkter herunder bandager, vandfiltre, maling, etc.10,11,12. Det er blevet påvist, at disse typer af forbindelser kan være giftige for nogle typer af pattedyrceller13.
Ampere vise fremragende antimikrobielle og immunmodulerende egenskaber14,15, og bakterier synes at finde det meget vanskeligt at udvikle en modstand mod dem16. Men, processen med at producere ren ampere er dyre; en fuldskala-produktionen er derfor ikke bæredygtigt. Således udviklet strategier til at imødegå problemerne i producerer forstærkere har været (f.eks., lille Molekylær antibakterielle peptoid efterligner17, peptoids18, α-peptider19 og β-peptider20). Methacrylat-ended polypeptider og polypeptoids er blevet syntetiseret for antimikrobielle og antifouling belægninger21.
Udvikling af nye antimikrobielle stoffer såsom avancerede materialer i ren eller hybrid form, stand til at forebygge og behandle multiresistente infektioner, er stadig mere nødvendig. En bred vifte af nye avancerede materialer til mange bioteknologi felter som væv og bioproces engineering er blevet udviklet med forbedrede kemiske og fysiske egenskaber i de sidste årtier gennem flere metoder: plasma-polymerisering podning på en hydrofobe substrat22,23,24, tilpasning af crosslinking massefylde25,26, polymerisering i løsning27,28,29 , 30, porogen opløsning31,32, og ved indarbejdelse af nanomaterialer såsom graphene oxid (GO)33,34,35,36 og Carbon nanofibers (CNFs)37.
Undersøgelse af disse nye materialer antimikrobiel kapacitet øges eksponentielt deres potentielle bioteknologi anvendelighed og er derfor blevet væsentligt. Vi præsenterer en nem at følge protokollen for at kvantificere den antimikrobiel aktivitet af sådanne nye avancerede materialer. Her, efter prøveforberedelse, to komplementære metoder er fulgt: først er baseret på agar disk diffusion test38 (diffusion metode) og andet er baseret på ISO 22196:2007 normen39 til måling af antimikrobiel aktivitet på materielle overflader (kontakt metode).
Den antimikrobielle aktivitet af nye avancerede materialer kan analyseres ved denne let at følge protokol bestående af 2 supplerende procedurer baseret på 2 eksisterende metoder: agar disk diffusion teste38 og den antimikrobielle aktivitet målt på materielle overflader efter ISO 22196:2007 normen39.
I feltet forskning er mange af de antimikrobielle test rapporteret i litteraturen højt assay-afhængige. Derfor er det meget vigtigt at have detaljerede og sammenhængende protokoller på plads på tværs af laboratorier. Denne artikel er et skridt i retningen. Derudover kunne det være meget nyttigt for mange forskere, der er mindre erfaren på dette område og kræver dybtgående, trinvise procedurer til at følge for præcise resultater.
Denne protokol kan bruges med mange typer materiale skæres i disk figurer på 10 mm i diameter. Sprøde materialer kan være hævet i en egnet opløsningsmiddel for 1 h til at gengive opskæringsprocessen lettere. Hydrofile materialer som alginates kan således være hydreret i autoklaveres destilleret vand. Andre opløsningsmidler som ethanol, keton og dichlormethan, kan være ansat til at svulme hydrofobe materialer til 1 time før skære dem. Men nogle materialer som poly(3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyvalerate) behøver ikke at være hævet, og de kan blive skåret direkte. Efter dette er det meget vigtigt at tør prøve materiale diskene i et vakuum ovn og sterilisere hver prøven med ethanol og UV-stråling i 1 time for at undgå enhver risiko for forurening.
Denne protokol anbefaler TSA og TSB som kultur medier og brugen af renkulturer af 3 mikroorganismer til at nå en bred vifte af mikroorganismer: Gram-positive bakterier Staphylococcus aureus, gramnegative bakterier Escherichia coli, og gær Candida albicans. Dog kunne alternative kultur medier og andre mikroorganismer har behov for forskellige inkubation betingelser også anvendes med denne protokol. Nogle gange, er kun 1 mikroorganisme testet til at have en oprindelige idé af antimikrobiel aktivitet af et nyt materiale.
De materialer, der viser stærk antimikrobiel aktivitet mod de anbefalede 3 forskellige typer af mikroorganismer bør også testes mod antibiotika-resistente patogene organismer såsom methicillin-resistente Staphylococcus epidermidis (MRSE), som har været med succes udnyttet med denne protokol. Andre vigtige resistente mikroorganismer, som forårsager megen bekymring er den Gram-positive methicillin-resistente Staphylococcus aureus (MRSA) og vancomycin-resistente enterokokker (VRE) og den gramnegative Pseudomonas aeruginosa40,41.
Biofilm hæmning og antimikrobiel aktivitet af materialer mod andre typer af mikroorganismer som virus og parasitter kan ikke testes med denne protokol. Men denne protokol giver et meget godt udgangspunkt for en antimikrobiel undersøgelse af en ny avanceret materiale.
I antimikrobiel agar disk diffusion test opstår et kritisk skridt når prøven disk skal være placeret i midten af pladen, fordi nogle materialer fold så snart de kommer i kontakt med agar medier. I dette tilfælde anbefales det at bruge et sterile par pincet skal omhyggeligt udfolde prøven. På den anden side i kontaktmetode, det er afgørende at vaske kontrollen og prøve diske meget godt med PBS af pipettering dem fire gange efterfulgt af en kraftig vortexing og ultralydbehandling for at sikre, at ingen levedygtige mikroorganismer forbliver overholdt til materialet overflade.
Denne video protokol kan udnyttes i mange bioteknologiske applikationer, såsom bioproces engineering, vævsmanipulering, kontrolleret medicinafgivelse, emballagematerialer, spildevandsbehandling og landbrug, som bruger biomaterialer med et højt ønskeligt antimikrobiel kapacitet.
De opnåede resultater med denne protokol er kvalitativ (billeder) og kvantitative (normaliseret bredden af den antibakterielle “halo” og tabet af levedygtighed) med en god analyse af dens reproducerbarhed (gennemsnit ± standardafvigelse). Når man sammenligner forskellige materialer, skal disse middelværdier, der er opnået med diffusion og kontakt metode resultater analysen analyseres ved en-vejs ANOVA, efterfulgt af Tyrkiets post hoc analyse, for at studere hvis de er, statistisk signifikant forskellige (p < 0,01).
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne vil gerne anerkende Universidad Católica de Valencia San Vicente Mártir for den finansielle støtte til dette arbejde gennem 2017-231-001UCV og 2018-231-001UCV tilskud.
Cylindrical punch | 10 mm diameter | ||
Petri dishes | soria genlab | P101 | 90 mm diameter, sterile |
Tryptic soy agar (TSA) | Liofilchem | 610052 | Dehydrated medium 500 g (powder) |
Tryptic soy broth (TSB) | Liofilchem | 610053 | Dehydrated medium 500 g (powder) |
Sterile cotton swab | EUTOTUBO | 300200 | |
Centrifuge tubes | VIDRA FOC, SA | 429900 | 50 mL, sterile |
Ethanol | VWR | 83813360 | Absolute ethanol |
Sterile 48-wells plate | COSTAR | 3548 | Flat bottom with lid, tissue culture treated, non-pyrogenic, polystyrene |
A pair of tweezers | BRAUN | 24612036 | Toothless |
Sterile phosphate buffered saline (PBS). | VWR | E404-100TAPBS | |
Vaccum oven with a connected vacuum pump | JP Selecta, SA | 5900620 | |
Laminar flow hood | TELSTAR Technologies, SL | TELSTAR AH-100 | 12.0 W lamp of UV-C radiation |
Class II Biological safety cabinet | LABOGENE | MARS 1200 | |
Incubator | ASTEC CO, LTD | SCA-165DR | |
Vortex mixer | Biosan | V-1 Plus | |
Spectrophotometer | Macherey-Nagel, Germany | Nanocolor UV/VIS II | |
Bunsen burner | JP Selecta, SA | 7001539 | |
Alcohol burner | VIDRA FOC, SA | 1658/20 | In case sterilisation is necessary to be performed inside class II biological safety cabinet |
Orbital shaker | sartorius stedim | 8864845 | |
Sonicator | SELECTA | 3000617 | 50/60 Hz |
Digital calliper | ACHA | 17-260 | 0-150 mm |
Serological pipette | Fisherbrand | 13-678-11 | 25 mL, sterile |
Serological pipette | VWR | 612-4950 | 5 mL, sterile |
Serological pipette | VWR | 612-5541 | 10 mL, sterile |
Micropipette | GILSON | FA10005P | Pipetman L P200L, plastic 20-200 µL |
Micropipette | GILSON | F123602 | Pipetman P1000, 200-1000 µL |
Micropipette | GILSON | FA10016 | Pipetman L P12X300L, 20-300 µL |
Micropipette tips | LABBOX | TIBP-200-960 | 2-200 µL |
Micropipette tips | LABBOX | TIBP-1K0-480 | 100-1000 µL |
Pre-sterilized tube | INSULAB | 301402 | 10 mL |
Photo camera | Canon EOS 5D | Any camera with high resolution can also be utilized | |
Gram-positive bacteria Staphylococcus aureus | strain V329 | Cucarella et al. J Bacteriol 183 (9), 2888–2896 (2001) | |
Gram-negative bacteria Escherichia coli | Colección Española de Cultivos Tipo CECT | CECT 101 | |
Yeast Candida albicans | Colección Española de Cultivos Tipo CECT | CECT 1394 | |
Microcentrifuge tubes | DASLAB | 175508 | 1,5 mL |
Autoclave | JP Selecta, SA | 4002136 | |
Spectrophotometer-cuvettes | UVAT Bio CB | F-0902-02 | 4,5 mL |
Drigalski spatula | LABBOX | SPRP-L05-1K0 | Sterile, disposable |
glass balls (2 mm diameter) | Hecht Karl | 1401/2 | Autoclavable, alternative device to the Drigalski spatula |
Autoclave bags | DELTALAB | 200318 | To sterilize microbiological residues or contaminated material |
Electronic pipette filling device | JetPip | JET BIOFIL | |
Laboratory bottle with ISO thread, graduated, borosilicate 3.3 | LABBOX | SBG3-100-010 | 100 mL, for autoclaving culture media |
Laboratory bottle with ISO thread, graduated, borosilicate 3.3 | LABBOX | SBG3-250-010 | 250 mL, for autoclaving culture media |
Laboratory bottle with ISO thread, graduated, borosilicate 3.3 | LABBOX | SBG3-500-010 | 500 mL, for autoclaving culture media |
Laboratory bottle with ISO thread, graduated, borosilicate 3.3 | LABBOX | SBG3-1K0-010 | 1000 mL, for autoclaving culture media |
Latex gloves | DENIA | 2278000000 | |
Indicator tape for sterilization | LABBOX | STAP-A55-001 | Self-adhesive tape with impregnated paper turning to colour when exposed to sterilization process. |
Universal test tube rack | LABBOX | MTSP-001-001 | To hold centrifuge tubes |
Microcentrifuge tube rack | VWR | 211-0210 | To hold microcentrifuge tubes |
Sterile loop | ACEFE S.A. | 100140055 | 10 µL of capacity for microbial culture |
Material M1 | Universidad Católica de Valencia San Vicente Mártir (UCV) | Material type 1 | |
Material M2 | Universidad Católica de Valencia San Vicente Mártir (UCV) | Material type 2 | |
Material M3 | Universidad Católica de Valencia San Vicente Mártir (UCV) | Material type3 | |
Material M4 | Universidad Católica de Valencia San Vicente Mártir (UCV) | Material type 4 | |
Material C | Universidad Católica de Valencia San Vicente Mártir (UCV) | Control material |