Мы представляем протокол для антибактериальной характеристика современных материалов. Здесь, антимикробной активности на поверхности материала измеряется двумя методами, которые дополняют друг друга: один основан на тестирование диффузии диска агар, и другой — стандартная процедура, основанный на норме ISO 22196:2007.
Разработка новых современных материалов с усиленными свойствами становится все более и более важным в широком диапазоне приложений биоинженерии. Таким образом многие Роман биоматериалов предназначены для имитации конкретных условий, необходимых для биомедицинских приложений, таких как тканевой инженерии и доставки контролируемых наркотиков. Разработка материалов с улучшенными свойствами для иммобилизации клеток или ферменты также является текущей темы исследования в Биопроцесс технологий. Однако один из самых привлекательных свойств материала в этих приложениях является антимикробным потенциала для избежания любых нежелательных инфекций. Для этого мы представляем easy-to последующие протоколы для антибактериальной характеристики материалов, основанных на (i) агар тестового диска диффузии (метод диффузии) и (ii) 22196:2007 нормой ISO для измерения антимикробной активности на поверхности материала (контакт метод). Этот протокол должен производиться с использованием грамположительных и грамотрицательных бактерий и дрожжей чтобы охватить широкий спектр микроорганизмов. В качестве примера 4 материалов с различной химической природы проверяются после этот Протокол против золотистый стафилококк, кишечная палочкаи Candida albicans. Результаты этих испытаний выставку не антимикробной активности для первый материал и увеличивая антибактериальную активность против грамположительных и грамотрицательных бактерий для других 3 материалов. Однако ни один из 4 материалов способны подавлять рост Candida albicans.
Имплантат неудачи часто является следствием микробных инфекций, которые происходят несмотря на антибактериальной профилактики и асептических условий труда. Эта проблема вызывает весьма высокие расходы на здравоохранение и тревогу среди пациентов1. Важных бактерий, таких как золотистый стафилококк , в настоящее время считаются весьма опасных патогенов в госпитальных инфекций, связанных с катетеры и других медицинских имплантатов и являются основными загрязнителями медицинских инструментов2. Таким образом разработка Роман антимикробной стратегий срочно необходима для ежедневных и медицинского использования.
Противомикробных препаратов включают антибиотики3, соединения аммония четвертичные4, ионов/оксиды металлов5и антимикробных пептидов (AMPs)6. Антибиотики постепенно становится менее эффективной из-за бактериальной резистентности,7, которая находится на подъеме благодаря антибиотика чрезмерное8. Соединения аммония четвертичные лишь весьма эффективны для краткосрочного использования из-за резистентности микроорганизмов9. Ионов/оксиды металлов давно использовались в качестве весьма эффективного антимикробных агентов и используются во многих общих коммерческих продуктов включая бинты, фильтры для воды, краски и т.д.10,,1112. Однако доказано, что эти виды соединений могут быть токсичными для некоторых типов клеток млекопитающих13.
Усилители показывают отличные противомикробные и иммуномодулирующие свойства14,15, и бактерии, как представляется, найти его очень трудно развивать устойчивость против них16. Однако процесс для производства чистого AMPs дорого; Таким образом крупномасштабное производство не является жизнеспособным. Таким образом разработаны стратегии борьбы, которые были проблемы в производстве AMPs (например, небольшой молекулярной антибактериальная peptoid имитирует17, peptoids18, α-пептиды19 и β-пептиды20). Метакрилат закончился полипептидов и polypeptoids синтезированы для противомикробным и необрастающие покрытия21.
Разработка новых противомикробных препаратов такие материалы в чистом или гибридных форм, состоянии для предотвращения и лечения лекарственно устойчивых инфекций, все более необходимым. Широкий спектр новых современных материалов для многих биоинженерии областях таких как ткани и Биопроцесс техники разработаны с улучшенными свойствами химические и физические в последние десятилетия через несколько методов: полимеризация в плазме подсадка на гидрофобные субстрата22,23,24, пошив сшивки плотности25,26, полимеризации в решение27,,2829 , 30, porogen распада31,32и путем включения в нее наноматериалы как графен оксид (GO)33,34,,3536 и Углеродные нановолокна (CNFs)37.
Изучение антимикробных потенциала этих новых материалов может экспоненциально увеличить их потенциальную применимость биоинженерии и таким образом, стал важным. Мы представляем easy-to последующие протокол для количественного определения антимикробной активности таких новых современных материалов. Здесь, после пробоподготовки, следуют два дополнительных метода: первый основан на агаре диска диффузии тест38 (метод диффузии) и второй основан на ISO 22196:2007 норма39 для измерения активности антимикробной на Материал поверхности (контактный метод).
Антимикробная активность новых передовых материалов могут быть проанализированы настоящим Протоколом easy-to последующие, состоящий из 2 дополнительных процедур, основанных на 2 существующие методы: агар диска диффузии тест38 и антимикробной активности измеряется на Материал поверхности согласно норме ISO в 22196:200739.
В этой области исследований многие из антимикробной тесты, описанные в литературе зависят от весьма пробирного. Таким образом, это очень важно, чтобы иметь подробную и последовательной протоколов в различных лабораториях. Эта статья представляет собой шаг в этом направлении. Кроме того это может быть очень полезным для многих исследователей, которые обладают меньшим опытом в этой области и требуют углубленного, пошаговые процедуры для получения точных результатов.
Этот протокол может использоваться с много типов материалов, нарезать формы диска диаметром 10 мм. Хрупких материалов может быть опухшими в подходящего растворителя для 1 h для отображения процесса резки легче. Таким образом гидрофильные материалы, такие как альгинаты можно гидратированных в газобетона дистиллированной воды. Другие растворители, такие как этанол, кетонов и дихлорметан, могут быть использованы для набухают гидрофобные материалы за 1 ч до резки их. Однако некоторые материалы, такие как poly(3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyvalerate) не нужно быть опухшими и они могут быть сокращены непосредственно. После этого очень важно для сухой образца материала диски в вакуумной печи и стерилизовать каждый образец с этанолом и УФ-излучения для 1 h чтобы избежать любого риска загрязнения.
Этот протокол рекомендует TSA и БСЭ как носителей культуры и использование чистых культур 3 микроорганизмов для достижения широкого спектра микроорганизмов: грамположительные бактерии золотистого стафилококка, грамотрицательные бактерии Escherichia coli, и дрожжи Candida albicans. Однако альтернативные культуры средств массовой информации и других микроорганизмов, нуждаются в различных инкубационных условий может также использоваться с настоящим Протоколом. Иногда только 1 микроорганизма проверяется иметь первоначальное представление о антимикробной активности нового материала.
Материалы, показаны сильной антибактериальной активностью против рекомендуется 3 различных видов микроорганизмов также должны быть проверены в отношении антибиотикоустойчивых патогенов, таких как метициллин резистентный стафилококк (MRSE), который были успешно использованы с настоящим Протоколом. Другие важные лекарственно устойчивых микроорганизмов, которые вызывают большую озабоченность, являются грамположительных метициллин резистентный золотистый стафилококк (MRSA) и к ванкомицину энтерококков (VRE) и грамотрицательных Синегнойной палочки40,41.
Ингибирование биопленки и антимикробной активности материалов против других видов микроорганизмов, таких как вирусы и паразитов не может испытываться с этот протокол. Однако этот протокол расширенный весьма полезной отправной точкой для антибактериальной изучения нового материала.
В тесте диффузии диска антимикробной агар важнейшим шагом происходит, когда диск образец должен находиться в центре пластины, потому что некоторые материалы раз, как только они получают при контакте с агар СМИ. В этом случае рекомендуется использовать стерильные пара пинцеты тщательно разворачиваться образца. С другой стороны в методе контакта, важно мыть управления и образца диски очень хорошо с PBS, закупорить их четыре раза следуют активные vortexing и sonication для обеспечения того, чтобы не жизнеспособные микроорганизмы остаются приклеенная к материалу поверхности.
Этот видео-протокол может использоваться во многих приложениях биоинженерии, например Биопроцесс ткани и проектирование, поставки контролируемых наркотиков, упаковочные материалы, сточных вод и сельского хозяйства, которые используют биоматериалов с высокой желательно антимикробным потенциала.
Результаты, полученные с этого протокола являются качественными (изображения) и количественный (нормализованное ширина антибактериальные «halo» и утрата жизнеспособности) с хорошим анализом его воспроизводимости (среднее ± стандартное отклонение). При сравнении различных материалов, эти средние значения, полученные с анализа результатов метода диффузии и контакты должны быть проанализированы на одностороннюю ANOVA, следуют Турции должность Специального анализа, для того, чтобы учиться, если они являются, по статистике, значительно разные (p < 0.01).
The authors have nothing to disclose.
Авторы хотели бы признать Universidad Católica де Валенсия-Сан-Висенте Мартир для финансовой поддержки для этой работы через 2017-231-001UCV и предоставляет 2018-231-001UCV.
Cylindrical punch | 10 mm diameter | ||
Petri dishes | soria genlab | P101 | 90 mm diameter, sterile |
Tryptic soy agar (TSA) | Liofilchem | 610052 | Dehydrated medium 500 g (powder) |
Tryptic soy broth (TSB) | Liofilchem | 610053 | Dehydrated medium 500 g (powder) |
Sterile cotton swab | EUTOTUBO | 300200 | |
Centrifuge tubes | VIDRA FOC, SA | 429900 | 50 mL, sterile |
Ethanol | VWR | 83813360 | Absolute ethanol |
Sterile 48-wells plate | COSTAR | 3548 | Flat bottom with lid, tissue culture treated, non-pyrogenic, polystyrene |
A pair of tweezers | BRAUN | 24612036 | Toothless |
Sterile phosphate buffered saline (PBS). | VWR | E404-100TAPBS | |
Vaccum oven with a connected vacuum pump | JP Selecta, SA | 5900620 | |
Laminar flow hood | TELSTAR Technologies, SL | TELSTAR AH-100 | 12.0 W lamp of UV-C radiation |
Class II Biological safety cabinet | LABOGENE | MARS 1200 | |
Incubator | ASTEC CO, LTD | SCA-165DR | |
Vortex mixer | Biosan | V-1 Plus | |
Spectrophotometer | Macherey-Nagel, Germany | Nanocolor UV/VIS II | |
Bunsen burner | JP Selecta, SA | 7001539 | |
Alcohol burner | VIDRA FOC, SA | 1658/20 | In case sterilisation is necessary to be performed inside class II biological safety cabinet |
Orbital shaker | sartorius stedim | 8864845 | |
Sonicator | SELECTA | 3000617 | 50/60 Hz |
Digital calliper | ACHA | 17-260 | 0-150 mm |
Serological pipette | Fisherbrand | 13-678-11 | 25 mL, sterile |
Serological pipette | VWR | 612-4950 | 5 mL, sterile |
Serological pipette | VWR | 612-5541 | 10 mL, sterile |
Micropipette | GILSON | FA10005P | Pipetman L P200L, plastic 20-200 µL |
Micropipette | GILSON | F123602 | Pipetman P1000, 200-1000 µL |
Micropipette | GILSON | FA10016 | Pipetman L P12X300L, 20-300 µL |
Micropipette tips | LABBOX | TIBP-200-960 | 2-200 µL |
Micropipette tips | LABBOX | TIBP-1K0-480 | 100-1000 µL |
Pre-sterilized tube | INSULAB | 301402 | 10 mL |
Photo camera | Canon EOS 5D | Any camera with high resolution can also be utilized | |
Gram-positive bacteria Staphylococcus aureus | strain V329 | Cucarella et al. J Bacteriol 183 (9), 2888–2896 (2001) | |
Gram-negative bacteria Escherichia coli | Colección Española de Cultivos Tipo CECT | CECT 101 | |
Yeast Candida albicans | Colección Española de Cultivos Tipo CECT | CECT 1394 | |
Microcentrifuge tubes | DASLAB | 175508 | 1,5 mL |
Autoclave | JP Selecta, SA | 4002136 | |
Spectrophotometer-cuvettes | UVAT Bio CB | F-0902-02 | 4,5 mL |
Drigalski spatula | LABBOX | SPRP-L05-1K0 | Sterile, disposable |
glass balls (2 mm diameter) | Hecht Karl | 1401/2 | Autoclavable, alternative device to the Drigalski spatula |
Autoclave bags | DELTALAB | 200318 | To sterilize microbiological residues or contaminated material |
Electronic pipette filling device | JetPip | JET BIOFIL | |
Laboratory bottle with ISO thread, graduated, borosilicate 3.3 | LABBOX | SBG3-100-010 | 100 mL, for autoclaving culture media |
Laboratory bottle with ISO thread, graduated, borosilicate 3.3 | LABBOX | SBG3-250-010 | 250 mL, for autoclaving culture media |
Laboratory bottle with ISO thread, graduated, borosilicate 3.3 | LABBOX | SBG3-500-010 | 500 mL, for autoclaving culture media |
Laboratory bottle with ISO thread, graduated, borosilicate 3.3 | LABBOX | SBG3-1K0-010 | 1000 mL, for autoclaving culture media |
Latex gloves | DENIA | 2278000000 | |
Indicator tape for sterilization | LABBOX | STAP-A55-001 | Self-adhesive tape with impregnated paper turning to colour when exposed to sterilization process. |
Universal test tube rack | LABBOX | MTSP-001-001 | To hold centrifuge tubes |
Microcentrifuge tube rack | VWR | 211-0210 | To hold microcentrifuge tubes |
Sterile loop | ACEFE S.A. | 100140055 | 10 µL of capacity for microbial culture |
Material M1 | Universidad Católica de Valencia San Vicente Mártir (UCV) | Material type 1 | |
Material M2 | Universidad Católica de Valencia San Vicente Mártir (UCV) | Material type 2 | |
Material M3 | Universidad Católica de Valencia San Vicente Mártir (UCV) | Material type3 | |
Material M4 | Universidad Católica de Valencia San Vicente Mártir (UCV) | Material type 4 | |
Material C | Universidad Católica de Valencia San Vicente Mártir (UCV) | Control material |