Konjugation-induzierte fluoreszierende pegylierten virusähnliche Partikel durch Dibromomaleimide-Disulfid Chemie zu machen
Summary
Hier präsentieren wir Ihnen eine Prozedur zum eindringmittel Funktionalisieren Disulfides auf Qβ VLP mit Dibromomaleimide. Wir beschreiben Qβ Ausdruck und Reinigung, die Synthese von Molekülen Dibromomaleimide funktionalisiert und die Konjugation-Reaktion zwischen Dibromomaleimide und Qβ. Das daraus resultierende gelbe fluoreszierende konjugierte Teilchen kann als Fluoreszenz Sonde innerhalb der Zellen verwendet werden.
Abstract
Der jüngste Anstieg virusähnliche Partikel (untersuchten) in biomedizinischen und Materialforschung kann einfache Biosynthese, diskrete Größe, genetische Programmierbarkeit und biologische Abbaubarkeit zugeschrieben werden. Während sie biokonjugaten Reaktionen für das Hinzufügen von synthetischen Liganden auf ihrer Oberfläche sehr zugänglich sind, ist das Angebot in biokonjugaten Methoden auf diese wässrigen geboren Capsids relativ begrenzt. Um die Ausrichtung der funktionalen Biomaterialien Forschung zu erleichtern, müssen nicht traditionele biokonjugaten Reaktionen berücksichtigt werden. Die Reaktion in diesem Protokoll beschriebenen verwendet Dibromomaleimides, neue Funktionen in dem Lösungsmittel vorstellen exponierten Disulfid-Bindungen der ein VLP Bakteriophagen Qβ zugrunde. Darüber hinaus ist das Endprodukt Leuchtstofflampen, die hat den zusätzlichen Vorteil eine verfolgbaren in-vitro- Sonde mit einem handelsüblichen Filtersatz zu erzeugen.
Introduction
Mit viralen Capsids nanogrösse entstanden als ein spannendes Gebiet, die darauf abzielt, die Ausweitung der Anwendungen in der biomedizinischen Forschung1,2,3. Rekombinant ausgedrückt virusähnliche Partikel (untersuchten) strukturell Viren abgeleitet sind, aber es fehlt das original virale Erbgut so dass sie nicht-infektiösen proteinhaltige Nanopartikel. Da die Oberflächen-Features genetisch programmiert sind und jede Kapsid sich identisch zu den davor und dahinter drückt, ist es möglich, die Lage und Anzahl der reaktiven Seitenketten der Aminosäuren mit atomistischen Präzision kennen. In vielen Fällen besitzen die äußeren und inneren Oberflächen viele Arten von Lösungsmittel ausgesetzt Aminosäurereste, die praktisch durch biokonjugaten Reaktionen – Reaktionen funktionalisiert werden können, die bilden kovalente Bindungen zwischen ein Biomolekül und ein synthetisches Molekül-4,–5.
Biokonjugaten Reaktionen helfen Biomoleküle von Interesse vielfältigere Funktionen auf relativ einfache Weise haben. Moleküle von Interesse, wie Medikamente6, fluoreszierende Tags7 und Polymere8,9 können Pre synthetisiert und charakterisiert, bevor sie auf der Oberfläche des untersuchten zugeordnet sind. Eine besonders häufige VLP in biomedizinischen und Biomaterialien Forschung wurde der VLP basiert auf Bakteriophagen Qβ, die als rekombinant ausgedrückt, ein 28 nm ikosaedrischen Kapsid virale10. Die häufigsten Lokalisationen der Reaktion auf Qβ sind Lysines bei weitem, obwohl wir vor kurzem die erfolgreiche Konjugation11 Dibromomaleimide Verbindungen zu den reduzierten Disulfides kommuniziert haben, die die Poren des Qβ über eine Haddleton-Baker-Reaktion säumen. Die Reaktion verläuft mit gutem Ertrag und ebenso wichtig ist, ohne die thermische Stabilität der Partikel zu verlieren. Zur gleichen Zeit erzeugt diese Reaktion Konjugation-induzierte Fluoreszenz, die verwendet werden, um die Aufnahme dieser Partikel in Zellen zu verfolgen. In dieser Arbeit zeigen wir die Konjugation von Polyethylenglykol (PEG) auf die Oberfläche des Qβ durch die Haddleton-Baker-Reaktion, die Ergebnisse in einem hellen gelben Fluorophor. Diese Partikel können dann verfolgt werden, wie sie von den Zellen aufgenommen werden. Das Protokoll hier hilft Forschern neue fluoreszierende pegylierten Qβ, proteinhaltige Nanopartikel Grundlage zu generieren, obwohl seine Prinzipien auf einer der vielen anderen untersuchten mit Lösungsmittel ausgesetzt Disulfides anwendbar sind.
Protocol
Representative Results
Discussion
Im Vergleich zu kleineren Proteinreinigung, ist ein einzigartiger Schritt bei der Reinigung von Bakteriophagen Qβ der Saccharose gradient Zentrifugation. Nach dem Chloroform/n-Butanol Extraktionsschritt wird Qβ weiter gereinigt mit 5-40 % Saccharose Steigungen. Bei der Zentrifugation werden Partikel anhand ihrer Größe getrennt. Größere Partikel Reisen in die höhere Dichte-Region, während kleinere Partikel in der niedrigeren Dichte Region bleiben. Qβ reist in das untere Drittel des Farbverlaufs und verweilt dort,…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
J.J.G. erkennt die National Science Foundation (DMR-1654405) und Cancer Prevention Research Institut of Texas (CPRIT) (RP170752s) für ihre Unterstützung.
Materials
| LB Broth (Miller) | EMD Millipore | 1.10285.0500 | |
| Tryptone, Poweder | Research Products International | T60060-1000.0 | |
| Yeast Extract, Poweder | Research Products International | Y20020-1000.0 | |
| Anhydrous magnesium sulfate | P212121 | CI-06808-1KG | |
| Sodium Chloride (Crystalline/Certified ACS) | Fisher Scientific | S271-10 | |
| Potassium Chloride | Fisher Scientific | BP366-500 | |
| Elga PURELAB Flex 3 Water Purification System | Fisher Scientific | 4474524 | |
| Potassium Phosphate Monobasic | Fisher Scientific | BP362-1 | |
| Potassium Phosphate Dibasic Anhydrous | Fisher Scientific | P288-500 | |
| Sucrose | Fisher Scientific | S25590B | |
| Ethanol | Fisher Scientific | BP2818500 | |
| Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) | Sigma Aldrich | I6758-1G | |
| Fiberlite F10-4×1000 LEX rotor | Fisher Scientific | 096-041053 | |
| Ammonium Sulfate | P212121 | KW-0066-5KG | |
| Chloroform | Alfa Aesar | 32614-M6 | |
| 1-Butanol | Fisher Scientific | A399-4 | |
| SW 28 Ti Rotor, Swinging Bucket, Aluminum | Beckman Coulter | 342204: SW 28 Ti Rotor/ 342217: Bucket Set | |
| Type 70 Ti Rotor, Fixed Angle, Titanium, 8 x 39 mL, | Beckman Coulter | 337922 | |
| Coomassie (Bradford) Protein Assay | Fisher Scientific | PI23200 | |
| TRIS Hydrochloride | Research Products International | T60050-1000.0 | |
| Tetramethylethylenediamine | Alfa Aesar | J63734-AC | |
| Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride | Sigma Aldrich | C4706-2G | |
| 2 3-Dibromomaleimide 97% | Sigma Aldrich | 553603-5G | |
| Polythylene Glycol | Alfa Aesar | 41561-22 | |
| Sodium Phosphate | Fisher Scientific | AC424375000 | |
| Acrylamide/bis-Acrylamide | P212121 | RP-A11310-500.0 | |
| Sodium dodecyl sulfate | Sigma Aldrich | L3771-100G | |
| Ammonium Persulfate | Fisher Scientific | BP179-100 | |
| FV3000 confocal laser scanning microscope | Olympus | FV3000 | |
| Labnet Revolver Adjustable Rotator | Thomas Scientific | 1190P25 | |
| 1000 mL Sorvall High Performance Bottle, PC, with Aluminum Cap | Thermo Scientific | 010-1459 | |
| Nalgene Centrifuge Bottles with Caps, Polypropylene Copolymer | Thermo Scientific | 3141-0250 | |
| Nunc Round-bottom tubes; 38 mL; PC | Thermo Scientific | 3117-0380 | |
| 2 L Narrow Mouth Erlenmeyer Flasks with Heavy Duty Rim | Pyrex | 4980-2L | |
| Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter Units | Millipore Sigma | UFC801024 | |
| M-110P Microfluidizer Materials Processor | Microfluidics | M-110P | |
| Nalgene High-Speed Polycarbonate Round Bottom Centrifuge Tubes | Thermo Scientific | 3117-0380PK | |
| Bottle, with Cap Assembly, Polycarbonate | Beckman Coulter | 41121703 | |
| Cylinder, Graduated – Polypropylene 250 mL | PolyLab | 80005 | |
| 533LS-E Series Steam Sterilizers | Getinge | 533LS-E | |
| TrueLine, Cell Culture Plate, Treated, PS, 96 Well, with Lid | LabSource | D36-313-CS | |
| Falcon 15 mL Conical Centrifuge Tube | Fisher Scientific | 14-959-53A | |
| Microcentifuge Tube: 1.5mL | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| VWR Os-500 Orbital Shaker | VWR Scientifc Products | 14005-830 | |
| Tetra Handcast systems | Bio-Rad | 1658000FC | |
| Polypropylene, 250 mL | Beckman Coulter | 41121703 | |
| Spectrofluorometer NanoDrop | Thermo Fisher Scientific | 3300 | |
| Long Needle | Hamilton | 7693 | |
| Exel International 5 to 6 cc Syringes Luer Lock | Fisher Scientific | 14-841-46 | |
| P1000 Pipetman | Gilson | F123602 | |
| P200 Pipetman | Gilson | F123601 | |
| P100 Pipetman | Gilson | F123615 | |
| P20 Pipetman | Gilson | F123600 | |
| P10 Pipetman | Gilson | F144802 | |
| Intel Weighing PM-100 Laboratory Classic High Precision Laboratory Balance | Intelligent Weighting Technology | IWT_PM100 | |
| Falcon 50 mL Conical Centrifuge Tube | Fisher Scientific | 14-432-22 | |
| 4–15% Mini-PROTEAN TGX Gel, 10 well, 50 µl | Bio-Rad | 456-1084 |
Referências
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