Dibromomaleimide 二硫化化学蛍光ペグインターフェロン ウイルス様粒子を抱合誘導を作る
Summary
蛍光 dibromomaleimide と Qβ VLP のジスルフィドを匹敵する手順を紹介します。Dibromomaleimide と Qβ との共役反応 dibromomaleimide 機能分子の合成と精製 Qβ 式について述べる。結果として得られる黄色蛍光共役粒子は細胞内蛍光プローブとして使用できます。
Abstract
近年医療ウイルス様粒子 (群集) の生合成、個々 のサイズ、遺伝的プログラミング、生分解性の容易さの材料研究を帰することができると。彼らは化反応反応表面で合成配位子を追加するために、これらの水溶液生まれカプシドに化反応方法論の範囲は比較的限られています。機能性材料研究の方向性を容易にする、非伝統的な化反応の反応を考慮されなければなりません。このプロトコルで記述されている反応は、バクテリオファージ Qβ に基づいて、VLP の露出のジスルフィド結合の溶媒に新しい機能を導入する dibromomaleimides を使用します。さらに、最終製品が蛍光、市販のフィルターのセットを使用して追跡可能な体外プローブの生成の付加的な利点を持っています。
Introduction
ナノサイズのウイルスのカプシドを使用してエキサイティングな分野、生物医学研究1,2,3のアプリケーションの範囲を拡大することを目的として浮上しています。Recombinantly 発現ウイルス様粒子 (群集) は構造的に、ウイルスから派生したが、彼らはそれらに非感染性のタンパク質粒子を作る元のウイルスの遺伝物質を欠いています。表面の特徴は、遺伝的プログラムし、各キャプシドはそれ前後のものに同じように表現の場所および原子レベルの精度でアミノ酸の反応性側鎖の数を知ることは不可能です。多くの場合、外装と内装の両方の表面には各種溶媒露出しているアミノ酸残基を動けなかった化反応反応合成、生体分子間に共有結合を形成する反応を官能基化することができますが所有しています。分子4,5。
化反応の反応は、比較的簡単な方法でより多様な機能を持って興味の分子を助けます。治療薬6、蛍光タグ7およびポリマー8,9など、興味の分子は事前合成でき、それらが群集の表面に接続された前に特徴付けられます。生体に特に一般的な VLP と生体材料研究 recombinantly 表現としては 28 nm の正二十面体のカプシド10バクテリオファージ Qβ に基づいて VLP をされています。Qβ に最も一般的な反応のサイトは、最近 dibromomaleimide ライン ハデルトン ベイカー反応による Qβ の毛穴縮小ジスルフィド化合物の成功活用11をお伝えしてきました、大差でリシンです。反応が良いと進む収量および、同様に重要なは、粒子の熱安定性を失うことなくが。同時にこの反応は、細胞にこれらの粒子の摂取量を追跡する使用ことができます活用誘起蛍光法を生成します。この作品は、明るい黄色の蛍光体にハデルトン ベイカー反応による Qβ の表面上にポリエチレング リコール (PEG) の活用を紹介します。彼らが細胞によってとられる、これらの粒子を追跡、ことができます。本プロトコルはその原則溶媒露出ジスルフィドを含む他の多くの群集の 1 つに適用されますが、タンパク質ナノ粒子 Qβ、に基づいて新しい蛍光ペグインターフェロンを生成の研究者を助けます。
Protocol
1. 準備 ホストゲノム スープ (LB) 寒天培地を作るし、プレート12を注ぐ。 WtQβ コート蛋白質シーケンスを含む pET28 プラスミドを持つ BL21(DE3) を変換します。 雪解けの氷浴で大腸菌BL21(DE3) 有能なセル。微量遠心チューブ内のセルの場所 50 μ L。 1 つの管にプラスミッドの 2 μ L を追加し、軽くはじきます。氷上で 30 分間イン?…
Representative Results
Dibromomaleimide 誘導体は、dibromomaleimide 無水物とアミン15間の縮合反応によって合成できます。また、N-メトキシカルボニル活性化 3, 4-dibromomaleimide を使用して穏やかな合成法16が収量 DB ・ ペッグ (図 1) に methoxypolyethylene リコール (PEG) と反応してここで悪用されました。NMR は、化合物の構造 (図 2</…
Discussion
ショ糖勾配遠心法に比べて小さい蛋白質の浄化、浄化バクテリオファージ Qβ でユニークなステップです。Qβ はクロロホルム/n-ブタノール抽出手順の後、5 ~ 40% のサッカロースの勾配を使用してをさらに純化されます。遠心分離中に粒子がそのサイズに基づいて分かれています。大きな粒子は小さな粒子のまま低密度地域における高密度領域に旅行します。Qβ はグラデーションのより低い三?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
J.J.G. は、彼らのサポートのための国立科学財団 (DMR-1654405) および癌防止研究所のテキサス (CPRIT) (RP170752s) を認めています。
Materials
| LB Broth (Miller) | EMD Millipore | 1.10285.0500 | |
| Tryptone, Poweder | Research Products International | T60060-1000.0 | |
| Yeast Extract, Poweder | Research Products International | Y20020-1000.0 | |
| Anhydrous magnesium sulfate | P212121 | CI-06808-1KG | |
| Sodium Chloride (Crystalline/Certified ACS) | Fisher Scientific | S271-10 | |
| Potassium Chloride | Fisher Scientific | BP366-500 | |
| Elga PURELAB Flex 3 Water Purification System | Fisher Scientific | 4474524 | |
| Potassium Phosphate Monobasic | Fisher Scientific | BP362-1 | |
| Potassium Phosphate Dibasic Anhydrous | Fisher Scientific | P288-500 | |
| Sucrose | Fisher Scientific | S25590B | |
| Ethanol | Fisher Scientific | BP2818500 | |
| Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) | Sigma Aldrich | I6758-1G | |
| Fiberlite F10-4×1000 LEX rotor | Fisher Scientific | 096-041053 | |
| Ammonium Sulfate | P212121 | KW-0066-5KG | |
| Chloroform | Alfa Aesar | 32614-M6 | |
| 1-Butanol | Fisher Scientific | A399-4 | |
| SW 28 Ti Rotor, Swinging Bucket, Aluminum | Beckman Coulter | 342204: SW 28 Ti Rotor/ 342217: Bucket Set | |
| Type 70 Ti Rotor, Fixed Angle, Titanium, 8 x 39 mL, | Beckman Coulter | 337922 | |
| Coomassie (Bradford) Protein Assay | Fisher Scientific | PI23200 | |
| TRIS Hydrochloride | Research Products International | T60050-1000.0 | |
| Tetramethylethylenediamine | Alfa Aesar | J63734-AC | |
| Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride | Sigma Aldrich | C4706-2G | |
| 2 3-Dibromomaleimide 97% | Sigma Aldrich | 553603-5G | |
| Polythylene Glycol | Alfa Aesar | 41561-22 | |
| Sodium Phosphate | Fisher Scientific | AC424375000 | |
| Acrylamide/bis-Acrylamide | P212121 | RP-A11310-500.0 | |
| Sodium dodecyl sulfate | Sigma Aldrich | L3771-100G | |
| Ammonium Persulfate | Fisher Scientific | BP179-100 | |
| FV3000 confocal laser scanning microscope | Olympus | FV3000 | |
| Labnet Revolver Adjustable Rotator | Thomas Scientific | 1190P25 | |
| 1000 mL Sorvall High Performance Bottle, PC, with Aluminum Cap | Thermo Scientific | 010-1459 | |
| Nalgene Centrifuge Bottles with Caps, Polypropylene Copolymer | Thermo Scientific | 3141-0250 | |
| Nunc Round-bottom tubes; 38 mL; PC | Thermo Scientific | 3117-0380 | |
| 2 L Narrow Mouth Erlenmeyer Flasks with Heavy Duty Rim | Pyrex | 4980-2L | |
| Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter Units | Millipore Sigma | UFC801024 | |
| M-110P Microfluidizer Materials Processor | Microfluidics | M-110P | |
| Nalgene High-Speed Polycarbonate Round Bottom Centrifuge Tubes | Thermo Scientific | 3117-0380PK | |
| Bottle, with Cap Assembly, Polycarbonate | Beckman Coulter | 41121703 | |
| Cylinder, Graduated – Polypropylene 250 mL | PolyLab | 80005 | |
| 533LS-E Series Steam Sterilizers | Getinge | 533LS-E | |
| TrueLine, Cell Culture Plate, Treated, PS, 96 Well, with Lid | LabSource | D36-313-CS | |
| Falcon 15 mL Conical Centrifuge Tube | Fisher Scientific | 14-959-53A | |
| Microcentifuge Tube: 1.5mL | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| VWR Os-500 Orbital Shaker | VWR Scientifc Products | 14005-830 | |
| Tetra Handcast systems | Bio-Rad | 1658000FC | |
| Polypropylene, 250 mL | Beckman Coulter | 41121703 | |
| Spectrofluorometer NanoDrop | Thermo Fisher Scientific | 3300 | |
| Long Needle | Hamilton | 7693 | |
| Exel International 5 to 6 cc Syringes Luer Lock | Fisher Scientific | 14-841-46 | |
| P1000 Pipetman | Gilson | F123602 | |
| P200 Pipetman | Gilson | F123601 | |
| P100 Pipetman | Gilson | F123615 | |
| P20 Pipetman | Gilson | F123600 | |
| P10 Pipetman | Gilson | F144802 | |
| Intel Weighing PM-100 Laboratory Classic High Precision Laboratory Balance | Intelligent Weighting Technology | IWT_PM100 | |
| Falcon 50 mL Conical Centrifuge Tube | Fisher Scientific | 14-432-22 | |
| 4–15% Mini-PROTEAN TGX Gel, 10 well, 50 µl | Bio-Rad | 456-1084 |
Referências
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Citar este artigo
Chen, Z., Detvo, S. T., Pham, E., Gassensmith, J. J. Making Conjugation-induced Fluorescent PEGylated Virus-like Particles by Dibromomaleimide-disulfide Chemistry. J. Vis. Exp. (135), e57712, doi:10.3791/57712 (2018).