Dibromomaleimide-아 황산 화학에 의해 형광 PEGylated 바이러스 같은 입자 활용 유도 만들기
Summary
여기, 선물이 붙일 functionalize dibromomaleimide와 Qβ VLP에 disulfides에 절차. 우리는 Qβ 식 및 정화, dibromomaleimide 기능성된 분자의 합성 및 dibromomaleimide와 Qβ 사이 활용 반응 설명합니다. 결과 노란색 형광 활용된 입자 셀 안에 형광 프로브로 사용할 수 있습니다.
Abstract
바이러스 같은 입자 (VLPs) 생물 의학에 있는 최근 증가 및 재료 연구 생 합성, 개별 크기, 유전자 프로그래밍 및 biodegradability의 그들의 용이 함에 표시 될 수 있습니다. 그들은 그들의 표면에 합성 ligands를 추가 하기 위한 bioconjugation 반응에 매우 의무가 있어, 이러한 수성 태어난된 capsids에 bioconjugation 방법론에서 범위 상대적으로 제한 됩니다. 촉진 하기 위해 기능성 생체 재료 연구의 방향, 비 전통적인 bioconjugation 반응은 고려 되어야 한다. 이 프로토콜에서 설명 하는 반응 dibromomaleimides를 사용 하 여 살 균 소 Qβ를 기반으로 한 VLP의 노출된 이황화 결합 용 매에서 새로운 기능을 소개. 또한, 최종 제품은 형광, 추적이 가능한 생체 외에서 프로브를 상업적으로 사용할 수 있는 필터 세트를 사용 하 여 생성의 이점이 있다 이다.
Introduction
바이러스 성 capsids 나노 크기를 사용 하 여 생물 의학 연구1,2,3응용 프로그램의 범위를 확대 하는 것을 목표로 하는 흥미 진 진한 필드로 떠오르고 있다. Recombinantly 표현된 바이러스 같은 입자 (VLPs)는 구조적으로 바이러스에서 파생 된 하지만 그들은 그들에 게 비 전염 성 배치할 나노 입자를 만드는 원래 바이러스 유전 물질 부족 합니다. 표면 기능 프로그램 유전자는 고 각 capsid 앞뒤 사람에 게 동일 하 게 표현 된다, 위치 및 원자 정밀도로 아미노산의 반응 측면 체인의 수를 알아야 가능 하다. 대부분의 경우에서 외부와 실내 표면 bioconjugation 반응-는 biomolecule와 합성 사이 공유 결합을 형성 하는 반응을 통해 functionalized feasibly 수 있습니다 용 매 노출된 아미노산 잔류물의 많은 종류를가지고 분자4,5.
Bioconjugation 반응 생체의 비교적 간단한 패션에서 더 다양 한 기능을가지고 도움이 됩니다. 분자의, 치료 약6, 형광 태그7 등 폴리머8,9 미리 합성 하 고 특징 VLPs의 표면에 연결 하기 전에 수 있습니다. 생물 의학에서 특히 일반적인 VLP 바이오 소재 연구, recombinantly 표현으로 28 nm icosahedral 바이러스 성 capsid10살 균 소 Qβ에 따라 VLP 되었습니다. 비록 우리가 최근에 Haddleton 베이커 반응을 통해 Qβ의 숨 구멍 줄 감소 disulfides dibromomaleimide 화합물의 성공적인 활용11 전달 Qβ에 가장 일반적인 반응 사이트 넓은 여백에 의해 lysines 있습니다. 반응 좋은 진행 항복 하 고, 동등 하 게 중요 한 것은, 입자의 열 안정성을 잃고 없이. 동시에이 반응을 활용 유도 형광, 셀으로이 입자의 통풍 관을 추적 하는 데 사용할 수 있습니다 생성 합니다. 이 작품에서는, 우리 Haddleton 베이커 반응, 밝은 노란색 fluorophore를 통해 Qβ의 표면에 폴 리 에틸렌 글리콜 (PEG)의 활용을 보여 줍니다. 이러한 입자 세포에 의해 그들은 촬영으로 추적할 수 있습니다. 본 프로토콜 연구원 원리 용 노출된 disulfides 포함 된 많은 다른 VLPs 중 하나에 적용 되는 새로운 형광 PEGylated 배치할 나노 입자를 기반으로 Qβ, 생성 도움이 됩니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
작은 단백질 정화에 비해, 살 균 소 Qβ 정화는 독특한 단계 자당 기온 변화도 원심 분리입니다. 클로 프롬/n-butanol 추출 단계 후 Qβ 5-40% 자당 기온 변화도 사용 하 여 더 순화 이다. 원심 분리, 중 입자는 그들의 크기에 따라 구분 됩니다. 더 큰 입자 작은 입자는 낮은 밀도 영역에 체류 하는 동안 더 높은 밀도 영역에 여행. Qβ는 그라데이션의 더 낮은 세 번째에 여행 하 고 더 작은 단백질 불순물은 원…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
J.J.G.는 그들의 지원에 대 한 국립 과학 재단 (DMR-1654405) 및 암 예방 연구 연구소의 텍사스 (CPRIT) (RP170752s)을 인정 한다.
Materials
| LB Broth (Miller) | EMD Millipore | 1.10285.0500 | |
| Tryptone, Poweder | Research Products International | T60060-1000.0 | |
| Yeast Extract, Poweder | Research Products International | Y20020-1000.0 | |
| Anhydrous magnesium sulfate | P212121 | CI-06808-1KG | |
| Sodium Chloride (Crystalline/Certified ACS) | Fisher Scientific | S271-10 | |
| Potassium Chloride | Fisher Scientific | BP366-500 | |
| Elga PURELAB Flex 3 Water Purification System | Fisher Scientific | 4474524 | |
| Potassium Phosphate Monobasic | Fisher Scientific | BP362-1 | |
| Potassium Phosphate Dibasic Anhydrous | Fisher Scientific | P288-500 | |
| Sucrose | Fisher Scientific | S25590B | |
| Ethanol | Fisher Scientific | BP2818500 | |
| Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) | Sigma Aldrich | I6758-1G | |
| Fiberlite F10-4×1000 LEX rotor | Fisher Scientific | 096-041053 | |
| Ammonium Sulfate | P212121 | KW-0066-5KG | |
| Chloroform | Alfa Aesar | 32614-M6 | |
| 1-Butanol | Fisher Scientific | A399-4 | |
| SW 28 Ti Rotor, Swinging Bucket, Aluminum | Beckman Coulter | 342204: SW 28 Ti Rotor/ 342217: Bucket Set | |
| Type 70 Ti Rotor, Fixed Angle, Titanium, 8 x 39 mL, | Beckman Coulter | 337922 | |
| Coomassie (Bradford) Protein Assay | Fisher Scientific | PI23200 | |
| TRIS Hydrochloride | Research Products International | T60050-1000.0 | |
| Tetramethylethylenediamine | Alfa Aesar | J63734-AC | |
| Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride | Sigma Aldrich | C4706-2G | |
| 2 3-Dibromomaleimide 97% | Sigma Aldrich | 553603-5G | |
| Polythylene Glycol | Alfa Aesar | 41561-22 | |
| Sodium Phosphate | Fisher Scientific | AC424375000 | |
| Acrylamide/bis-Acrylamide | P212121 | RP-A11310-500.0 | |
| Sodium dodecyl sulfate | Sigma Aldrich | L3771-100G | |
| Ammonium Persulfate | Fisher Scientific | BP179-100 | |
| FV3000 confocal laser scanning microscope | Olympus | FV3000 | |
| Labnet Revolver Adjustable Rotator | Thomas Scientific | 1190P25 | |
| 1000 mL Sorvall High Performance Bottle, PC, with Aluminum Cap | Thermo Scientific | 010-1459 | |
| Nalgene Centrifuge Bottles with Caps, Polypropylene Copolymer | Thermo Scientific | 3141-0250 | |
| Nunc Round-bottom tubes; 38 mL; PC | Thermo Scientific | 3117-0380 | |
| 2 L Narrow Mouth Erlenmeyer Flasks with Heavy Duty Rim | Pyrex | 4980-2L | |
| Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter Units | Millipore Sigma | UFC801024 | |
| M-110P Microfluidizer Materials Processor | Microfluidics | M-110P | |
| Nalgene High-Speed Polycarbonate Round Bottom Centrifuge Tubes | Thermo Scientific | 3117-0380PK | |
| Bottle, with Cap Assembly, Polycarbonate | Beckman Coulter | 41121703 | |
| Cylinder, Graduated – Polypropylene 250 mL | PolyLab | 80005 | |
| 533LS-E Series Steam Sterilizers | Getinge | 533LS-E | |
| TrueLine, Cell Culture Plate, Treated, PS, 96 Well, with Lid | LabSource | D36-313-CS | |
| Falcon 15 mL Conical Centrifuge Tube | Fisher Scientific | 14-959-53A | |
| Microcentifuge Tube: 1.5mL | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| VWR Os-500 Orbital Shaker | VWR Scientifc Products | 14005-830 | |
| Tetra Handcast systems | Bio-Rad | 1658000FC | |
| Polypropylene, 250 mL | Beckman Coulter | 41121703 | |
| Spectrofluorometer NanoDrop | Thermo Fisher Scientific | 3300 | |
| Long Needle | Hamilton | 7693 | |
| Exel International 5 to 6 cc Syringes Luer Lock | Fisher Scientific | 14-841-46 | |
| P1000 Pipetman | Gilson | F123602 | |
| P200 Pipetman | Gilson | F123601 | |
| P100 Pipetman | Gilson | F123615 | |
| P20 Pipetman | Gilson | F123600 | |
| P10 Pipetman | Gilson | F144802 | |
| Intel Weighing PM-100 Laboratory Classic High Precision Laboratory Balance | Intelligent Weighting Technology | IWT_PM100 | |
| Falcon 50 mL Conical Centrifuge Tube | Fisher Scientific | 14-432-22 | |
| 4–15% Mini-PROTEAN TGX Gel, 10 well, 50 µl | Bio-Rad | 456-1084 |
Referências
- Pokorski, J., Breitenkamp, K., Liepold, L., Qazi, S., Finn, M. G. Functional Virus-Based Polymer-Protein Nanoparticles by Atom Transfer Radical Polymerization. J. Am. Chem. Soc. 133 (24), 9242-9245 (2011).
- Capehart, S., Coylet, M., Glasgow, J., Francis, M. Controlled Integration of Gold Nanoparticles and Organic Fluorophores Using Synthetically Modified MS2 Viral Capsids. J. Am. Chem. Soc. 135 (8), 3011-3016 (2013).
- Li, S., et al. Template-Directed Synthesis of Porous and Protective Core-Shell Bionanoparticles. Angew. Chem. Int. Ed. 55 (36), 10691-10696 (2016).
- Chen, Z., Li, N., Li, S., Dharmarwardana, M., Schlimme, A., Gassensmith, J. J. Viral Chemistry: The Chemical Functionalization of Viral Architectures to Create New Technology. WIREs. Nanomed. Nanobiotechnol. 8 (4), 512-534 (2015).
- Chalker, J. M., Bernardes, G. J. L., Lin, Y. A., Davis, B. G. Chemical modification of proteins at cysteine: opportunities in chemistry and biology. Chem. – Asian J. 4 (5), 630-640 (2009).
- Le, D. H., Lee, K. L., Shukla, S., Commandeur, U., Steinmetz, N. F. Potato Virus X, a Filamentous Plant Viral Nanoparticle for Doxorubicin Delivery in Cancer Therapy. Nanoscale. 9 (6), 2348-2357 (2017).
- Chen, L., Wu, Y., Yuan, L., Wang, Q. Virus-templated FRET Platform for the Rational Design of Ratiometric Fluorescent Nanosensors. Chem. Comm. 51 (50), 10190-10193 (2015).
- Lee, P., et al. Polymer Structure and Conformation Alter the Antigenicity of Virus-like Particle-Polymer Conjugates. J. Am. Chem. Soc. 139 (9), 3312-3315 (2017).
- Zhang, X., et al. Polymer-Protein Core-Shell Nanoparticles for Enhanced Antigen Immunogenicity. ACS Macro Lett. 6 (4), 442-446 (2017).
- Brown, S. D., Fielder, J. D., Finn, M. G. Assembly of Hybrid Bacteriophage Qbeta virus-like particles. Bioquímica. 48 (47), 11155-11157 (2009).
- Chen, Z., et al. Fluorescent Functionalization across Quaternary Structure in a Virus- like Particle. Bioconjugate Chem. 28 (9), 2277-2283 (2017).
- . Pouring LB Agar Plates Available from: https://www.addgene.org/protocols/pouring-lb-agar-plates/ (2016)
- Smith, M., et al. Protein Modification, Bioconjugation, and Disulfide Bridging Using Bromomaleimides. J. Am. Chem. Soc. 132 (6), 1960-1965 (2010).
- Castaneda, L., et al. A Mild Synthesis of N-functionalised Bromomaleimides, Thiomaleimides and Bromopyridazinediones. Tetrahedron Lett. 54 (27), 3493-3495 (2013).
- Fiedler, J., et al. Engineered Mutations Change the Structure and Stability of a Virus- Like Particle. Biomacromolecules. 13 (8), 2339-2348 (2012).
- Manzenrieder, F., Luxenhofer, R., Retzlaff, M., Jordan, R., Finn, M. G. Stabilization of Virus-like Particles with Poly(2-oxazoline)s. Angew. Chem. Int. Ed. 50 (11), 2601-2605 (2011).
- Chen, Z., Li, N., Chen, L., Lee, J., Gassensmith, J. J. Dual Functionalized Bacteriophage Qβ as a Photocaged Drug Carrier. Small. 12 (33), 4563-4571 (2016).
