Aqui, apresentamos um procedimento para funcionalizar fluorescente os dissulfetos na Qβ VLP com dibromomaleimide. Descrevemos Qβ expressão e purificação, a síntese de moléculas de dibromomaleimide-acrescida e a reação de conjugação entre dibromomaleimide e Qβ. A partícula de conjugado fluorescente amarela resultante pode ser usada como uma sonda de fluorescência no interior das células.
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Artigo de método
Fazendo induzida por conjugação fluorescentes peguilado vírus-como partículas pela química do bissulfeto de Dibromomaleimide
Neste artigo
Resumo
Resumo
A ascensão recente em partículas vírus-like (VLP) em biomédica e pesquisa de materiais pode ser atribuída à sua facilidade de biossíntese, tamanho discreto, programação genética e biodegradabilidade. Enquanto eles são altamente favoráveis para reações de bioconjugation para a adição de ligantes sintéticos em sua superfície, o intervalo em metodologias de bioconjugation sobre estes capsids nascidos aquosas é relativamente limitado. Para facilitar a direção da pesquisa de biomateriais funcionais, devem considerar-se reações de bioconjugation não-tradicionais. A reação descrita neste protocolo usa dibromomaleimides para introduzir a nova funcionalidade no solvente dissulfeto expostas de um VIP com base em Qβ do bacteriófago. Além disso, o produto final é fluorescente, que tem a vantagem de gerar uma sonda controlável em vitro , usando um conjunto de filtro disponíveis comercialmente.
Introdução
Usar capsids virais nanométricas emergiu como um campo excitante, que visa alargar o âmbito de aplicações em pesquisa biomédica1,2,3. Recombinantes expressas partículas vírus-like (VLP) são estruturalmente derivadas de vírus, mas falta-lhes o material genético viral original tornando-os não-infecciosa nanopartículas proteicas. Como as características de superfície são geneticamente programadas e cada capsídeo é expressa forma idêntica aos antes e depois dela, é possível saber a localização e o número de cadeias de lado reativo dos aminoácidos com precisão atomística. Em muito....
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Protocolo
1. preparação
- Fazer o ágar-ágar lisogenia caldo (LB) e despeje placas12.
-
Transforme o BL21(DE3) com um plasmídeo pET28 que contém a sequência de proteínas de revestimento wtQβ.
- Descongele células competentes de Escherichia coli BL21(DE3) em um banho de gelo. Colocar 50 μL de células em um tubo de microcentrifugadora.
- Adicionar 2 μL do plasmídeo em um tubo e agite suavemente o tubo. Então incube no gelo por 30 min.
- Calor-choque as células para 45 s num banho de água que é exatamente a 42 ° c. Coloque o tubo de volta no banho de gelo imediatamente após calor-choque e i....
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Resultados
Os derivados do dibromomaleimide podem ser sintetizados através da reação de condensação entre anidrido dibromomaleimide e aminas primárias15. Como alternativa, um método sintético suave16 usando N-metoxicarbonil ativado 3,4-dibromomaleimide aqui foi explorada por reagir com methoxypolyethylene glicol (PEG) de rendimento DB-PEG (Figura 1). NMR foi usado para identificar a estrutura de compostos (
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Discussão
Comparado a purificação de proteínas menor, um único passo na purificação do bacteriófago Qβ é a centrifugação gradiente de sacarose. Após a etapa de extração de clorofórmio/n-butanol, Qβ ainda mais purified usando gradientes de sacarose 5-40%. Durante a centrifugação, as partículas são separadas com base em seus tamanhos. Partículas maiores viajam à região de densidade mais elevada, enquanto que partículas menores fica na região da baixa densidade. Qβ viaja para o terço inferior do gradiente e permanece lá enquanto impu.......
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Divulgações
Os autores declaram que eles têm não tem interesses financeiro concorrente.
Agradecimentos
J.J.G. reconhece a Fundação Nacional de ciência (DMR-1654405) e câncer prevenção Research Institute of Texas (CPRIT) (RP170752s) pelo seu apoio.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Caldo LB (Miller) | EMD Millipore | 1.10285.0500 | |
| Triptona, Poweder | Research Products International | T60060-1000.0 | |
| Extrato de Levedura, Poweder | Research Products International | Y20020-1000.0 | |
| Sulfato de magnésio anidro | P212121 | CI-06808-1KG | |
| Cloreto de Sódio (ACS cristalino / certificado) | Fisher Scientific | S271-10 | |
| Cloreto de potássio | Fisher Scientific | BP366-500 | |
| Elga PURELAB Flex 3 Sistema de purificação de água | Fisher Scientific | 4474524 | |
| Fosfato de potássio monobásico | Fisher Scientific | BP362-1 | |
| Fosfato de potássio dibásico anidro Fisher | Scientific | P288-500 | |
| Sacarose | Fisher Scientific | ||
| Etanol | Fisher Scientific | BP2818500 | |
| Isopropil β-D-1-tiogalactopiranosídeo (IPTG) | Sigma Aldrich | I6758-1G | |
| Fiberlite F10-4x1000 LEX rotor | Fisher Scientific | 096-041053 | |
| Sulfato de Amônio | P212121 | KW-0066-5KG | |
| Clorofórmio | Alfa Aesar | 32614-M6 | |
| 1-Butanol | Fisher Scientific | A399-4 | |
| SW 28 Ti Rotor, Balde Oscilante, Alumínio | Beckman Coulter | 342204: SW 28 Ti Rotor/ 342217: Conjunto | |
| Tipo 70 Ti Rotor, Ângulo Fixo, Titânio, 8 x 39 mL, | Beckman Coulter | 337922 | |
| Coomassie (Bradford) Ensaio de Proteína | Fisher Scientific | PI23200 | |
| TRIS Hydrochloride | Research Products International | T60050-1000.0 | |
| Tetrametiletilenodiamina | Alfa Aesar | J63734-AC | |
| Cloridrato de Tris(2-carboxietil)fosfina | Sigma Aldrich | C4706-2G | |
| 2 3-Dibromomaleimida 97% | Sigma Aldrich | 553603-5G | |
| Polietilenoglicol | Alfa Aesar | 41561-22 | |
| Fosfato de Sódio | Fisher Scientific | AC424375000 | |
| Acrilamida / bis-Acrilamida | P212121 | RP-A11310-500.0 | |
| Dodecil sulfato de sódio | Sigma Aldrich | L3771-100G | |
| Persulfato de Amônio | Fisher Scientific | BP179-100 | |
| FV3000 microscópio confocal de varredura a laser | Olympus | FV3000 | |
| Revólver Labnet Ajustável Rotator | Thomas Scientific | 1190P25 | |
| Garrafa de Alto Desempenho Sorvall de 1000 mL, PC, com Tampa de Alumínio | Thermo Scientific | 010-1459 | |
| Frascos de Centrífuga Nalgene com Tampas, Copolímero de Polipropileno | Thermo Scientific | 3141-0250 | |
| Nunc Tubos de fundo redondo; 38 mL; PC | Thermo Scientific | 3117-0380 | |
| 2 L Frascos Erlenmeyer de boca estreita com borda resistente | Pyrex | 4980-2L | |
| Amicon Ultra-4 | Millipore Sigma | UFC801024 | |
| M-110P Microfluidizer Materials Processor | Microflufluidics | M-110P | |
| Nalgene Tubos de centrífuga de fundo redondo de policarbonato de alta velocidade | Thermo Garrafa Scientific | 3117-0380PK | |
| , com Montagem de Tampa, Policarbonato | Beckman Coulter | 41121703 | |
| Cilindro, Graduado - Polipropileno 250 mL | Esterilizadores a Vapor da Série PolyLab | 80005 | |
| 533LS-E | Getinge | 533LS-E | |
| TrueLine, Placa de Cultura de Células, Tratada, PS, 96 Poços, com Tampa | LabSource | D36-313-CS | |
| Tubo de Centrífuga Cônica Falcon 15 mL | Fisher Scientific | 14-959-53A | |
| Tubo Microcentifuge: 1.5mL | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| VWR Os-500 Agitador Orbital | VWR Scientifc Products | 14005-830 | |
| Tetra Handcast systems | Bio-Rad | 1658000FC | |
| Polipropileno, 250 mL | Beckman Coulter | 41121703 | |
| Espectrofluorômetro NanoDrop | Thermo Fisher Scientific | 3300 | |
| Long Needle | Hamilton | 7693 | |
| Exel International Seringas de 5 a 6 cc Luer Lock | Fisher Scientific | 14-841-46 | |
| P1000 Pipetman | Gilson | F123602 | |
| P200 Pipetman | Gilson | F123601 | |
| P100 Pipetman | Gilson | F123615 | |
| P20 Pipetman | Gilson | F123600 | |
| P10 Pipetman | Gilson | ||
| Intel Weighing PM-100 Laboratory Classic High Precision Laboratory Balance | de Ponderação Inteligente | IWT_PM100 | |
| Falcon Tubo de Centrífuga Cônica de 50 mL | Fisher Scientific | 14-432-22 | |
| 4– 15% Mini-PROTEAN TGX Gel, 10 poços, 50 µ l | Bio-Rad | 456-1084 |
Referências
- Pokorski, J., Breitenkamp, K., Liepold, L., Qazi, S., Finn, M. G. Functional Virus-Based Polymer-Protein Nanoparticles by Atom Transfer Radical Polymerization. J. Am. Chem. Soc. 133 (24), 9242-9245 (2011).
- Capehart, S., Coylet, M., Glasgow, J., Francis, M.
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Reimpressões e permissões
