Desafio jovens neurônios em novas regiões do cérebro pode revelar importantes insights sobre como o ambiente esculpe, maturação e destino neuronal. Este protocolo descreve um procedimento para colheita precursores interneurônio de regiões específicas do cérebro e transplantá-las de qualquer homotopically ou heterotopically para o cérebro dos filhotes pós-natal.
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Artigo de método
Homochronic transplante de precursores interneurônio nos cérebros de Mouse pós-natal precoce
Neste artigo
Resumo
Resumo
Maturação e determinação neuronal destino requer uma intrincada interação entre programas genéticos e sinais ambientais. No entanto, destrinçar os papéis de intrínseco versus extrínsecos mecanismos que regulam este processo de diferenciação é um enigma para todos os neurobiologists do desenvolvimento. Esta questão é ampliada para gabaérgica interneurônios, uma população celular incrivelmente heterogênea que nasce das estruturas embrionárias transitórias e passam por uma fase migratória prolongada para dispersar ao longo do telencéfalo. Para explorar diferentes como cérebro ambientes afetam interneurônio destino e maturação, desenvolvemos um protocolo para a colheita fluorescente etiquetadas interneurônio imaturo precursores de regiões específicas do cérebro em ratos recém-nascidos (P0-P2). Nesta idade, migração de interneurônio está quase completa e estas células são residentes em seus ambientes de descanso finais com relativamente pouca integração sináptica. Coleção de soluções de célula única via citometria de fluxo, na sequência destes precursores interneurônio são transplantados P0-P2 sua filhotes pós-natal. Através da realização de ambos homotopicamente (por exemplo, córtex-para-córtex) ou heterotópica (por exemplo, córtex-para-hipocampo) transplantes, pode avaliar como desafiador interneurônios imaturos em novos ambientes de cérebro afeta seu destino, maturação e integração do circuito. Cérebro pode ser colhido em ratos adultos e analisado com uma grande variedade de análises posthoc enxertados em células, incluindo a imuno-histoquímica, eletrofisiológicos e transcriptional de criação de perfil. Esta abordagem geral fornece investigadores com uma estratégia a ensaiar como distintos ambientes do cérebro podem influenciar numerosos aspectos do desenvolvimento do neurônio e identificar se especificidade neuronal é conduzida principalmente por programas genéticos hardwired ou Dicas ambientais.
Introdução
Função cortical adequada requer um equilíbrio entre neurônios de projeção excitatória e inibitória gabaérgica interneurônios, uma população extremamente heterogêneo com morfologias distintas, Propriedades eletrofisiológicas, conectividade e neuroquímicos marcadores. Desenvolvimento anormal e função de interneurônios (e subgrupos específicos interneurônio) tem sido associada com o Patobiológico de transtornos psiquiátricos como esquizofrenia, autismo e epilepsia1,2,3. Além disso, muitos genes implicados nestes distúrbios cerebrais são fortemente enriquecidos em interneurônios ....
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Protocolo
Todos os procedimentos experimentais foram realizados em conformidade com as diretrizes do National Institutes of Health e foram aprovados pelo cuidado do Animal de FORMULADORES e Comissão de utilização (ACUC). O protocolo descrito abaixo utiliza Nkx2.1-CreC / +; Ai9+ /- filhotes para colher precursores interneurônio MGE-derivado, mas podem ser executadas em qualquer linha de rato repórter fluorescentes desejado. Masculinos e femininos ratos pós-natal precoce (P0-P2) foram utilizados indiscriminadamente para tecido doador e host.
1. preparação da solução
- Prepare-se sacarose artificial líquido cefalo....
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Resultados
Este protocolo demonstra como colheita de regiões cerebrais específicas do cérebro pós-natal precoce (Figura 1-2), coletar dissociações única célula de precursores interneurônio e transplante dessas células em várias regiões do cérebro ingênuo WT filhotes pós-natal (Figura 3). Para análises posthoc, cérebros que recebeu interneurônio precursor enxertos foram colhidos entre P30-35 para caracterizar a morfologia ce.......
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Discussão
Um aspecto crítico deste protocolo é maximizar a capacidade de sobrevivência das células. Garantindo que os tecidos e as células são sempre em sACSF de carboxygenated fria como o gelo é necessário promover a sobrevivência da pilha. Isto requer uma dissecção eficiente e estratégia de dissociação para minimizar o comprimento de tempo que as células gastam em solução várias e fora do ambiente do cérebro. Dependendo do número de regiões do cérebro sendo dissecado e transplantados, pode ser útil ter um parceiro nas etapas a d.......
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Divulgações
Os autores não têm nada para divulgar.
Agradecimentos
Esta pesquisa foi apoiada pelo National Institutes of Health (K99MH104595) e o programa de pesquisa intramural FORMULADORES para T.J.P. Agradecemos Gord Fishell, em cujo laboratório esta abordagem foi estabelecida originalmente.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Cloreto de sódio | Sigma | S7653 | |
| Bicarbonato de sódio | Sigma | S6297 | |
| Cloreto de potássio | Sigma | P9541 | |
| Fosfato de sódio monobásico | Sigma | S0751 | |
| Cloreto de cálcio | Sigma | C5080 | |
| Cloreto de magnésio | Sigma | M2670 | |
| Glicose | Sigma | G7528 | |
| Sacarose | Sigma | S7903 | |
| Matrizes cerebrais | Roboz | SA-2165 | Só é necessário se a colheita do estriado |
| Ponta fina Dumont Fórceps | Roboz | RS-4978 | |
| Tesoura de microdissecação | Roboz | RS-5940 | |
| Lâminas de barbear | ThermoFisher | 12-640 | |
| Pipetas Pasteur | ThermoFisher | 1367820C | |
| Nanoject III | Drummond | 3-000-207 | |
| Manipulador Manual com suporte | World Precision Instruments | M3301R/M10 | |
| Tubos de plástico de fundo redondo de 5 ml | ThermoFisher | 149591A | |
| Placas de Petri de 60 mm Placas de Petri | ThermoFisher | 12556001 Placas de | |
| Petri de 100 mm | ThermoFisher | 12565100 | |
| Pronase | Sigma | 10165921001 | |
| Soro Fetal Bovino (FBS) | ThermoFisher | 16140063 | |
| DNase I | Sigma | 4716728001 | |
| Celltrics 50um filtros | Sysmex | 04-0042327 | |
| Trypan azul | ThermoFisher | 15-250-061 | |
| Hemocitômetro | ThermoFisher | 02-671-6 |
Referências
- Bozzi, Y., Casarosa, S., Caleo, M. Epilepsy as a neurodevelopmental disorder. Front Psychiatry. 3 (19), (2012).
- Takano, T. Interneuron Dysfunction in Syndromic Autism: Recent Advances. Dev Neurosci. , (2015).
- Inan, M., Petros, T. J., Anderson, S. A.
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Reimpressões e permissões
