Homochronic transplante de precursores interneurônio nos cérebros de Mouse pós-natal precoce

Summary

Desafio jovens neurônios em novas regiões do cérebro pode revelar importantes insights sobre como o ambiente esculpe, maturação e destino neuronal. Este protocolo descreve um procedimento para colheita precursores interneurônio de regiões específicas do cérebro e transplantá-las de qualquer homotopically ou heterotopically para o cérebro dos filhotes pós-natal.

Abstract

Maturação e determinação neuronal destino requer uma intrincada interação entre programas genéticos e sinais ambientais. No entanto, destrinçar os papéis de intrínseco versus extrínsecos mecanismos que regulam este processo de diferenciação é um enigma para todos os neurobiologists do desenvolvimento. Esta questão é ampliada para gabaérgica interneurônios, uma população celular incrivelmente heterogênea que nasce das estruturas embrionárias transitórias e passam por uma fase migratória prolongada para dispersar ao longo do telencéfalo. Para explorar diferentes como cérebro ambientes afetam interneurônio destino e maturação, desenvolvemos um protocolo para a colheita fluorescente etiquetadas interneurônio imaturo precursores de regiões específicas do cérebro em ratos recém-nascidos (P0-P2). Nesta idade, migração de interneurônio está quase completa e estas células são residentes em seus ambientes de descanso finais com relativamente pouca integração sináptica. Coleção de soluções de célula única via citometria de fluxo, na sequência destes precursores interneurônio são transplantados P0-P2 sua filhotes pós-natal. Através da realização de ambos homotopicamente (por exemplo, córtex-para-córtex) ou heterotópica (por exemplo, córtex-para-hipocampo) transplantes, pode avaliar como desafiador interneurônios imaturos em novos ambientes de cérebro afeta seu destino, maturação e integração do circuito. Cérebro pode ser colhido em ratos adultos e analisado com uma grande variedade de análises posthoc enxertados em células, incluindo a imuno-histoquímica, eletrofisiológicos e transcriptional de criação de perfil. Esta abordagem geral fornece investigadores com uma estratégia a ensaiar como distintos ambientes do cérebro podem influenciar numerosos aspectos do desenvolvimento do neurônio e identificar se especificidade neuronal é conduzida principalmente por programas genéticos hardwired ou Dicas ambientais.

Introduction

Função cortical adequada requer um equilíbrio entre neurônios de projeção excitatória e inibitória gabaérgica interneurônios, uma população extremamente heterogêneo com morfologias distintas, Propriedades eletrofisiológicas, conectividade e neuroquímicos marcadores. Desenvolvimento anormal e função de interneurônios (e subgrupos específicos interneurônio) tem sido associada com o Patobiológico de transtornos psiquiátricos como esquizofrenia, autismo e epilepsia^1,2,3. Além disso, muitos genes implicados nestes distúrbios cerebrais são fortemente enriquecidos em interneurônios ....

Protocol

Todos os procedimentos experimentais foram realizados em conformidade com as diretrizes do National Institutes of Health e foram aprovados pelo cuidado do Animal de FORMULADORES e Comissão de utilização (ACUC). O protocolo descrito abaixo utiliza Nkx2.1-Cre^{C / +}; Ai9^{+ /-} filhotes para colher precursores interneurônio MGE-derivado, mas podem ser executadas em qualquer linha de rato repórter fluorescentes desejado. Masculinos e femininos ratos pós-natal precoce (P0-P2) foram utilizados indiscriminadamente para tecido doador e host.

1. preparação da solução

1. Prepare-se sacarose artificial líquido cefalo....

Results

Este protocolo demonstra como colheita de regiões cerebrais específicas do cérebro pós-natal precoce (Figura 1-2), coletar dissociações única célula de precursores interneurônio e transplante dessas células em várias regiões do cérebro ingênuo WT filhotes pós-natal (Figura 3). Para análises posthoc, cérebros que recebeu interneurônio precursor enxertos foram colhidos entre P30-35 para caracterizar a morfologia ce.......

Discussion

Um aspecto crítico deste protocolo é maximizar a capacidade de sobrevivência das células. Garantindo que os tecidos e as células são sempre em sACSF de carboxygenated fria como o gelo é necessário promover a sobrevivência da pilha. Isto requer uma dissecção eficiente e estratégia de dissociação para minimizar o comprimento de tempo que as células gastam em solução várias e fora do ambiente do cérebro. Dependendo do número de regiões do cérebro sendo dissecado e transplantados, pode ser útil ter um parceiro nas etapas a d.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cloreto de sódio	Sigma	S7653
Bicarbonato de sódio	Sigma	S6297
Cloreto de potássio	Sigma	P9541
Fosfato de sódio monobásico	Sigma	S0751
Cloreto de cálcio	Sigma	C5080
Cloreto de magnésio	Sigma	M2670
Glicose	Sigma	G7528
Sacarose	Sigma	S7903
Matrizes cerebrais	Roboz	SA-2165	Só é necessário se a colheita do estriado
Ponta fina Dumont Fórceps	Roboz	RS-4978
Tesoura de microdissecação	Roboz	RS-5940
Lâminas de barbear	ThermoFisher	12-640
Pipetas Pasteur	ThermoFisher	1367820C
Nanoject III	Drummond	3-000-207
Manipulador Manual com suporte	World Precision Instruments	M3301R/M10
Tubos de plástico de fundo redondo de 5 ml	ThermoFisher	149591A
Placas de Petri de 60 mm Placas de Petri	ThermoFisher	12556001 Placas de
Petri de 100 mm	ThermoFisher	12565100
Pronase	Sigma	10165921001
Soro Fetal Bovino (FBS)	ThermoFisher	16140063
DNase I	Sigma	4716728001
Celltrics 50um filtros	Sysmex	04-0042327
Trypan azul	ThermoFisher	15-250-061
Hemocitômetro	ThermoFisher	02-671-6