En Flow flowcytometri-baserede analyse til måling af membran potentiale i hjerte Myocytes efter hypoxi/Reoxygenation
Summary
Vi præsenterer her, en protokol, der bruger JC-1 farvestof til at vurdere mitokondrielle membran celler efter at være udsat for iltsvind/reoxygenation med eller uden en beskyttende agent.
Abstract
Rettidig og effektiv reperfusion af tilstoppet koronararterie er den bedste strategi for faldende Myokardie infarkt størrelse hos patienter med en ST-segment forhøjet myokardieinfarkt. Dog kan reperfusion i sig selv resultere i yderligere cardiomyocyte død, et fænomen kendt som reperfusion skade. Åbningen af mitokondrie permeabilitet overgangen pore (mPTP), med fald i den potentielle membran (MMP), eller mitokondrie depolarisering, er almindeligt anerkendt som det sidste trin af reperfusion skade og er ansvarlig for mitokondrie og cardiomyocyte død. JC-1 er en lipofile kationiske farvestof, der ophobes i mitokondrierne afhængigt af værdien af MMP. Jo højere MMP er, jo mere JC-1 ophobes i mitokondrierne. De stigende mængder af JC-1 i mitokondrier kan afspejles af et fluorescens emission Skift fra green (~ 530 nm) til rød (~ 590 nm). Derfor, reduktion af røde/grønne fluorescens intensitet forholdet kan angive depolarisering af mitokondrier. Her, tager vi fordel af JC-1 til at måle MMP eller åbning af mPTP i menneskers hjerte myocytes efter hypoxi/reoxygenation, fundet ved flowcytometri.
Introduction
Koronar hjertesygdom er den hyppigste årsag til dødsfald på verdensplan. Behandling af valg er for at reducere iskæmisk skade og begrænse infarkt størrelse hos patienter med ST-segment forhøjet myokardieinfarkt rettidig og effektiv Myokardie reperfusion via primær perkutan koronar intervention (PCI)1, 2. Dog forårsager reperfusion yderligere skader, som kan tegne sig for op til 30 procent af den afsluttende infarkt størrelse3. Det er almindeligt anerkendt, at mitokondriel permeabilitet overgangen pore (mPTP) ikke er kun centrale i mitokondrie skader og celle død under iskæmi/reperfusion (jeg / R), men er også et konvergerende mål af cardioprotective signalering4 , 5. som mPTP åbningen vil medføre depolarisering af den indre mitokondrielle membran potentiale (MMP)4, vi opdaget mPTP åbning ved hjælp af 5, 5, 6, 6 ‘-Tetrachloro-1, 1′, 3, 3 ‘-tetraethyl-imidacarbocyanineiodide (JC-1) assay.
JC-1 analysen er en cytofluorimetric metode, der er både kvalitative og kvantitative, og yderligere er valideret ved at analysere MMP på niveau med en enkelt mitokondrier6. JC-1 eksisterer som en aggregeret form, giver en rød til orange farvede emission (590 ± 17,5 nm) i matrixen af mitochondrier med normal MMP; med tabet af MMP, er JC-1 konverteret til monomere form, der giver grønne fluorescens med en emission af 530 ± 15 nm. Derfor, et fald i rød/grøn fluorescens intensitet forholdet kunne angive reduktion af MMP i forhold såsom iskæmi/reperfusion (jeg / R).
Ud over JC-1, er MMP også blevet undersøgt med membran-gennemtrængelige lipofile kationer såsom rodamin 123 og 3, 3 ‘-dihexyloxadicarbocyanine Iodid [DiOC6(3)]. Men i forhold til disse to sonder, JC-1 er mere pålidelige til at analysere MMP. Rodamin 123 har relativt ringe følsomhed (især i dæmper tilstand7,8) og fattige specificitet. Skift i rodamin 123 er undertiden så lille, at det er svært for forskere eller udstyr til at observere/opdage. Desuden, i en enkelt celle, der er forskellige mitochondriet bindingssteder for rodamin 123 og så at det kan have forskellige fluorescens emissioner9. DiOC6(3) er ikke anbefalet til påvisning af MMP enten som det reagerer følsomt på depolarisering af plasma membran10.
Derfor, her bruger vi JC-1 analyse til at vurdere MMP HCMs efter at være udsat for iltsvind/reoxygenation med eller uden en beskyttende agent.
Protocol
Representative Results
Discussion
Her præsenterer vi en protokol, der bruger JC-1 farvestof til at vurdere MMP celler efter at være udsat for H/R. opdaget af JC-1 assay, MMP celler er uafhængig af faktorer såsom mitokondrie størrelse, form og massefylde, der kan påvirke single-komponent fluorescens signaler14. Resultaterne af JC-1 analysen er derfor forholdsvis pålidelig. Desuden er det praktisk og tidsbesparende at udføre JC-1 assay. Denne analyse har en lav krav til materialer og reagenser, og generelt, det tager mindre …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denne undersøgelse blev støttet af tilskud fra den nationale nøgle forskning og udvikling Program i Kina (nr. 2017YFC1700503), den nationale grundlæggende Research Program (973 Program) Kina (No.2012CB518602), den National Natural Science Foundation of China (nr. 81370223 og nr. 81573957), og kandidater Innovative Research Foundation i Peking Union Medical College (2016-1002-01-02).
Materials
| Mitochondrial membrane potential assay kit with JC-1 | Beyodtime, China | C2006 | In the kit there are JC-1 stock solution (200×), stock staining buffer (5×) and CCCP(10mM) |
| Tongxinluo ultrafine powder | Shijiazhuang Yiling Pharmaceutical Co., China | 071201 | |
| Annexin V-FITC/PI Kit | Becton-Dickinson, USA | 556547 | |
| DMEM | Life Technologies, Grand Island Biological Company, USA | 11966-025 | |
| Human cardiac myocyte | Promocell, Germany | C-12810 | |
| Myocyte Growth Medium (SupplementMix) |
Promocell, Germany | C-39275 | |
| Myocyte Growth Medium (Ready-to-use) | Promocell, Germany | C-22070 | used with Myocyte Growth Medium SupplementMix |
| GENbox | BioMérieux, Marcy l’Etoile, France | 96127 | 2.5L |
| Catalyst (AnaeroPack) | MITSUBISHI GAS CHEMICAL COMPANY, INC. , Japan | C-1 | |
| Anaerobic indicator | BioMérieux, Marcy l’Etoile, France | 96118 | |
| Flow cytometer | Becton-Dickinson, USA | FACSAria 2 | |
| BD FACSDiva Software | Becton-Dickinson, USA | Version8.0.1 | |
| Sample tube | Corning science, USA | 352054 | 12*75mm |
| PBS | Hyclone, USA | SH30256.01 |
Referências
- Anderson, J. L., Morrow, D. A. Acute Myocardial Infarction. New England Journal of Medicine. 376 (21), 2053-2064 (2017).
- Ibanez, B., et al. ESC Guidelines for the management of acute myocardial infarction in patients presenting with ST-segment elevation: The Task Force for the management of acute myocardial infarction in patients presenting with ST-segment elevation of the European Society of Cardiology (ESC). European Heart Journal. 39 (2), 119-177 (2017).
- Yellon, D. M., Hausenloy, D. J. Myocardial reperfusion injury. New England Journal of Medicine. 357 (11), 1121-1135 (2007).
- Ong, S. B., Samangouei, P., Kalkhoran, S. B., Hausenloy, D. J. The mitochondrial permeability transition pore and its role in myocardial ischemia reperfusion injury. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 78, 23-34 (2015).
- Heusch, G. Molecular basis of cardioprotection: signal transduction in ischemic pre-, post-, and remote conditioning. Circulation Research. 116 (4), 674-699 (2015).
- Cossarizza, A., Ceccarelli, D., Masini, A. Functional heterogeneity of an isolated mitochondrial population revealed by cytofluorometric analysis at the single organelle level. Experimental Cell Research. 222 (1), 84-94 (1996).
- Ward, M. W., Rego, A. C., Frenguelli, B. G., Nicholls, D. G. Mitochondrial membrane potential and glutamate excitotoxicity in cultured cerebellar granule cells. Journal of Neuroscience. 20 (19), 7208-7219 (2000).
- Perry, S. W., Norman, J. P., Barbieri, J., Brown, E. B., Gelbard, H. A. Mitochondrial membrane potential probes and the proton gradient: a practical usage guide. Biotechniques. 50 (2), 98-115 (2011).
- Cossarizza, A., Salvioli, S. Flow cytometric analysis of mitochondrial membrane potential using JC-1. Current Protocols in Cytometry. , 14 (2001).
- Salvioli, S., Ardizzoni, A., Franceschi, C., Cossarizza, A. JC-1, but not DiOC6(3) or rhodamine 123, is a reliable fluorescent probe to assess delta psi changes in intact cells: implications for studies on mitochondrial functionality during apoptosis. FEBS Letters. 411 (1), 77-82 (1997).
- Chen, G. H., et al. Inhibition of miR-128-3p by Tongxinluo Protects Human Cardiomyocytes from Ischemia/reperfusion Injury via Upregulation of p70s6k1/p-p70s6k1. Frontiers in Pharmacology. 8, 775 (2017).
- Cui, H., et al. Induction of autophagy by Tongxinluo through the MEK/ERK pathway protects human cardiac microvascular endothelial cells from hypoxia/reoxygenation injury. Journal of Cardiovascular Pharmacology. 64 (2), 180-190 (2014).
- Chen, J., et al. Lysophosphatidic acid protects mesenchymal stem cells against hypoxia and serum deprivation-induced apoptosis. Stem Cells. 26 (1), 135-145 (2008).
- Chazotte, B. Labeling mitochondria with JC-1. Cold Spring Harbor Protocols. (9), (2011).
- Pravdic, D., et al. Anesthetic-induced preconditioning delays opening of mitochondrial permeability transition pore via protein Kinase C-epsilon-mediated pathway. Anesthesiology. 111 (2), 267-274 (2009).
- Wu, Y., et al. Suppression of Excessive Histone Deacetylases Activity in Diabetic Hearts Attenuates Myocardial Ischemia/Reperfusion Injury via Mitochondria Apoptosis Pathway. Journal of Diabetes Research. 2017, 8208065 (2017).
- Qiu, Y., et al. Curcumin-induced melanoma cell death is associated with mitochondrial permeability transition pore (mPTP) opening. Biochemical and Biophysical Research Communications. 448 (1), 15-21 (2014).
- Zhen, Y. F., et al. P53 dependent mitochondrial permeability transition pore opening is required for dexamethasone-induced death of osteoblasts. Journal of Cell Physiology. 229 (10), 1475-1483 (2014).
- Nazarewicz, R. R., Dikalova, A. E., Bikineyeva, A., Dikalov, S. I. Nox2 as a potential target of mitochondrial superoxide and its role in endothelial oxidative stress. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 305 (8), H1131-H1140 (2013).
- Wang, T., Zhang, Z. X., Xu, Y. J. Effect of mitochondrial KATP channel on voltage-gated K+ channel in 24 hour-hypoxic human pulmonary artery smooth muscle cells. Chinese Medical Journal (Engl). 118 (1), 12-19 (2005).
- Kuter, N., Aysit-Altuncu, N., Ozturk, G., Ozek, E. The Neuroprotective Effects of Hypothermia on Bilirubin-Induced Neurotoxicity in vitro. Neonatology. 113 (4), 360-365 (2018).
- Zheng, Y. Y., Wang, M., Shu, X. B., Zheng, P. Y., Ji, G. Autophagy activation by Jiang Zhi Granule protects against metabolic stress-induced hepatocyte injury. World Journal of Gastroenterology. 24 (9), 992-1003 (2018).
- El Gamal, H., Eid, A. H., Munusamy, S. Renoprotective Effects of Aldose Reductase Inhibitor Epalrestat against High Glucose-Induced Cellular Injury. Biomed Research International. 2017, 5903105 (2017).
- Renault, T. T., Luna-Vargas, M. P., Chipuk, J. E. Mouse Liver Mitochondria Isolation, Size Fractionation, and Real-time MOMP Measurement. Bio-Protocols. 6 (15), (2016).
