Een stroom Cytometry gebaseerde Assay voor het meten van de Mitochondriale membraanpotentiaal in cardiale Myocytes na Hypoxia/heroxygenatie
Summary
Hier presenteren we een protocol dat gebruikmaakt van JC-1 kleurstof te beoordelen van de Mitochondriale membraanpotentiaal van cellen na wordt blootgesteld aan hypoxie/heroxygenatie met of zonder een beschermende agent.
Abstract
Tijdige en efficiënte reperfusie van de afgesloten kransslagader is de beste strategie voor het verkleinen van het myocard infarct bij patiënten met een ST-segment verheven myocardiaal infarct. Echter kan reperfusie per se resulteren in verdere cardiomyocyte dood, een fenomeen dat bekend staat als reperfusie letsel. De opening van de mitochondriale permeabiliteit overgang porie (mPTP), met een daling van de Mitochondriale membraanpotentiaal (MMP) of een mitochondriale depolarisatie, is algemeen erkend als de laatste stap van reperfusie letsel en is verantwoordelijk voor mitochondriale en dood van de cardiomyocyte. JC-1 is een lipofiele kationogene kleurstof dat zich in de mitochondriën afhankelijk van de waarde van MMP ophoopt. Hoe hoger de MMP is, hoe meer JC-1 hoopt zich op in de mitochondriën. De stijgende hoeveelheden voor JC-1 in de mitochondriën kunnen worden weergegeven door een verschuiving van de emissie fluorescentie van groen (~ 530 nm) tot rood (~ 590 nm). Dus, de vermindering van de fluorescentie van de rood/groen intensiteit verhouding kunt aangeven de depolarisatie van de mitochondriën. Hier, nemen wij voordeel van JC-1 voor het meten van MMP, of de opening van mPTP in menselijke cardiale myocytes na hypoxia/heroxygenatie, ontdekt door stroom cytometry.
Introduction
Coronaire hartziekte is de belangrijkste oorzaak van overlijden wereldwijd. De behandeling van keuze is voor vermindering van ischemische schade en de beperking van de grootte van het infarct in patiënten met ST-segment myocardiaal infarct verheven tijdige en effectieve myocardiale reperfusie via primaire percutane coronaire interventie (PCI)1, 2. Reperfusie veroorzaakt echter bijkomende schade, die kan goed zijn voor maximaal 30% van het laatste infarct grootte3. Het is algemeen erkend dat de mitochondriale permeabiliteit overgang porie (mPTP) niet alleen centraal in mitochondriale schade en cel dood tijdens ischemie/reperfusie is (Ik / R), maar is ook een convergerende doel van bescherming signalering4 , 5. als de mPTP-opening over depolarisatie van de innerlijke mitochondriale membraan potentiële (MMP)4 brengen zou, we ontdekt mPTP openen met behulp van de 5, 5 ‘, 6, 6 ‘-Tetrachloro-1, 1, 3, 3 ‘-tetraethyl-imidacarbocyanineiodide (JC-1) assay.
De bepaling van de JC-1 is een cytofluorimetric methode die zowel kwalitatief als kwantitatief, en het verder is gevalideerd door het analyseren van de MMP op het niveau van een enkele mitochondriën6. JC-1 bestaat als een geaggregeerde vorm, de opbrengst van een rood tot oranje gekleurde emissie (590 ± 17,5 nm) in de matrix van mitochondriën met normale MMP; met het verlies van MMP, wordt JC-1 geconverteerd naar de monomere vorm die groene fluorescentie met een uitstoot van 530 ± 15 nm levert. Dus een daling in de verhouding rood/groen fluorescentie intensiteit kan duiden op de verlaging van MMP in omstandigheden zoals ischemie/reperfusie (Ik / R).
Naast JC-1, is MMP ook bestudeerd met membraan-permeabele lipofiele kationen zoals Rhodamine 123 en 3, 3 ‘-dihexyloxadicarbocyanine jodide [DiOC6(3)]. Echter, vergeleken met deze twee sondes, JC-1 is meer betrouwbaar voor het analyseren van MMP. Rhodamine 123 heeft relatief arme gevoeligheid (vooral in het blussen van mode7,8) en slechte specificiteit. De verschuiving in rhodamine 123 is soms zo klein dat het is moeilijk voor onderzoekers of apparatuur om te observeren/detecteren. Bovendien, in een enkele cel, er zijn verschillende mitochondrion bandplaatsen voor rhodamine 123 en dus dat het verschillende fluorescentie emissies9kan hebben. DiOC6(3) wordt niet aanbevolen voor het opsporen van MMP hetzij als het gevoelig op de depolarisatie van plasmamembraan10 reageert.
Daarom hier gebruiken we de JC-1-test om te beoordelen de MMP van HCMs na wordt blootgesteld aan hypoxie/heroxygenatie met of zonder een beschermende agent.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hier presenteren we een protocol dat gebruikmaakt van JC-1 kleurstof te beoordelen van de MMP van cellen na wordt blootgesteld aan H/R. gedetecteerd door JC-1 test, de MMP van cellen is niet afhankelijk van factoren zoals de mitochondriale grootte, vorm en dichtheid die invloed op één-component fluorescentie hebben kan 14-signalen. Bijgevolg zijn de resultaten van JC-1 assay relatief betrouwbaar. Bovendien, het is handig en tijdbesparend voor het uitvoeren van de bepaling van de JC-1. Deze bepal…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Deze studie werd ondersteund door subsidies van de nationale sleutel Research en Development programma van China (nr. 2017YFC1700503), de National Basic Research Program (973 programma) van China (No.2012CB518602), de nationale Natural Science Foundation van China (nr. 81370223 en nr. 81573957), en de gediplomeerden innovatieve Research Foundation van Peking Unie Medical College (2016-1002-01-02).
Materials
| Mitochondrial membrane potential assay kit with JC-1 | Beyodtime, China | C2006 | In the kit there are JC-1 stock solution (200×), stock staining buffer (5×) and CCCP(10mM) |
| Tongxinluo ultrafine powder | Shijiazhuang Yiling Pharmaceutical Co., China | 071201 | |
| Annexin V-FITC/PI Kit | Becton-Dickinson, USA | 556547 | |
| DMEM | Life Technologies, Grand Island Biological Company, USA | 11966-025 | |
| Human cardiac myocyte | Promocell, Germany | C-12810 | |
| Myocyte Growth Medium (SupplementMix) |
Promocell, Germany | C-39275 | |
| Myocyte Growth Medium (Ready-to-use) | Promocell, Germany | C-22070 | used with Myocyte Growth Medium SupplementMix |
| GENbox | BioMérieux, Marcy l’Etoile, France | 96127 | 2.5L |
| Catalyst (AnaeroPack) | MITSUBISHI GAS CHEMICAL COMPANY, INC. , Japan | C-1 | |
| Anaerobic indicator | BioMérieux, Marcy l’Etoile, France | 96118 | |
| Flow cytometer | Becton-Dickinson, USA | FACSAria 2 | |
| BD FACSDiva Software | Becton-Dickinson, USA | Version8.0.1 | |
| Sample tube | Corning science, USA | 352054 | 12*75mm |
| PBS | Hyclone, USA | SH30256.01 |
Referências
- Anderson, J. L., Morrow, D. A. Acute Myocardial Infarction. New England Journal of Medicine. 376 (21), 2053-2064 (2017).
- Ibanez, B., et al. ESC Guidelines for the management of acute myocardial infarction in patients presenting with ST-segment elevation: The Task Force for the management of acute myocardial infarction in patients presenting with ST-segment elevation of the European Society of Cardiology (ESC). European Heart Journal. 39 (2), 119-177 (2017).
- Yellon, D. M., Hausenloy, D. J. Myocardial reperfusion injury. New England Journal of Medicine. 357 (11), 1121-1135 (2007).
- Ong, S. B., Samangouei, P., Kalkhoran, S. B., Hausenloy, D. J. The mitochondrial permeability transition pore and its role in myocardial ischemia reperfusion injury. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 78, 23-34 (2015).
- Heusch, G. Molecular basis of cardioprotection: signal transduction in ischemic pre-, post-, and remote conditioning. Circulation Research. 116 (4), 674-699 (2015).
- Cossarizza, A., Ceccarelli, D., Masini, A. Functional heterogeneity of an isolated mitochondrial population revealed by cytofluorometric analysis at the single organelle level. Experimental Cell Research. 222 (1), 84-94 (1996).
- Ward, M. W., Rego, A. C., Frenguelli, B. G., Nicholls, D. G. Mitochondrial membrane potential and glutamate excitotoxicity in cultured cerebellar granule cells. Journal of Neuroscience. 20 (19), 7208-7219 (2000).
- Perry, S. W., Norman, J. P., Barbieri, J., Brown, E. B., Gelbard, H. A. Mitochondrial membrane potential probes and the proton gradient: a practical usage guide. Biotechniques. 50 (2), 98-115 (2011).
- Cossarizza, A., Salvioli, S. Flow cytometric analysis of mitochondrial membrane potential using JC-1. Current Protocols in Cytometry. , 14 (2001).
- Salvioli, S., Ardizzoni, A., Franceschi, C., Cossarizza, A. JC-1, but not DiOC6(3) or rhodamine 123, is a reliable fluorescent probe to assess delta psi changes in intact cells: implications for studies on mitochondrial functionality during apoptosis. FEBS Letters. 411 (1), 77-82 (1997).
- Chen, G. H., et al. Inhibition of miR-128-3p by Tongxinluo Protects Human Cardiomyocytes from Ischemia/reperfusion Injury via Upregulation of p70s6k1/p-p70s6k1. Frontiers in Pharmacology. 8, 775 (2017).
- Cui, H., et al. Induction of autophagy by Tongxinluo through the MEK/ERK pathway protects human cardiac microvascular endothelial cells from hypoxia/reoxygenation injury. Journal of Cardiovascular Pharmacology. 64 (2), 180-190 (2014).
- Chen, J., et al. Lysophosphatidic acid protects mesenchymal stem cells against hypoxia and serum deprivation-induced apoptosis. Stem Cells. 26 (1), 135-145 (2008).
- Chazotte, B. Labeling mitochondria with JC-1. Cold Spring Harbor Protocols. (9), (2011).
- Pravdic, D., et al. Anesthetic-induced preconditioning delays opening of mitochondrial permeability transition pore via protein Kinase C-epsilon-mediated pathway. Anesthesiology. 111 (2), 267-274 (2009).
- Wu, Y., et al. Suppression of Excessive Histone Deacetylases Activity in Diabetic Hearts Attenuates Myocardial Ischemia/Reperfusion Injury via Mitochondria Apoptosis Pathway. Journal of Diabetes Research. 2017, 8208065 (2017).
- Qiu, Y., et al. Curcumin-induced melanoma cell death is associated with mitochondrial permeability transition pore (mPTP) opening. Biochemical and Biophysical Research Communications. 448 (1), 15-21 (2014).
- Zhen, Y. F., et al. P53 dependent mitochondrial permeability transition pore opening is required for dexamethasone-induced death of osteoblasts. Journal of Cell Physiology. 229 (10), 1475-1483 (2014).
- Nazarewicz, R. R., Dikalova, A. E., Bikineyeva, A., Dikalov, S. I. Nox2 as a potential target of mitochondrial superoxide and its role in endothelial oxidative stress. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 305 (8), H1131-H1140 (2013).
- Wang, T., Zhang, Z. X., Xu, Y. J. Effect of mitochondrial KATP channel on voltage-gated K+ channel in 24 hour-hypoxic human pulmonary artery smooth muscle cells. Chinese Medical Journal (Engl). 118 (1), 12-19 (2005).
- Kuter, N., Aysit-Altuncu, N., Ozturk, G., Ozek, E. The Neuroprotective Effects of Hypothermia on Bilirubin-Induced Neurotoxicity in vitro. Neonatology. 113 (4), 360-365 (2018).
- Zheng, Y. Y., Wang, M., Shu, X. B., Zheng, P. Y., Ji, G. Autophagy activation by Jiang Zhi Granule protects against metabolic stress-induced hepatocyte injury. World Journal of Gastroenterology. 24 (9), 992-1003 (2018).
- El Gamal, H., Eid, A. H., Munusamy, S. Renoprotective Effects of Aldose Reductase Inhibitor Epalrestat against High Glucose-Induced Cellular Injury. Biomed Research International. 2017, 5903105 (2017).
- Renault, T. T., Luna-Vargas, M. P., Chipuk, J. E. Mouse Liver Mitochondria Isolation, Size Fractionation, and Real-time MOMP Measurement. Bio-Protocols. 6 (15), (2016).
