Um ensaio de baseados em citometria de fluxo para medir o potencial de membrana mitocondrial em miócitos após hipóxia/reoxigenação

Resumo

Aqui, apresentamos um protocolo que usa JC-1 tintura para avaliar o potencial de membrana mitocondrial das células após serem expostos a hipóxia/reoxigenação com ou sem um agente protetor.

Resumo

Oportuna e eficiente de reperfusão da artéria coronária obstruída é a melhor estratégia para diminuir o tamanho do infarto do miocárdio em pacientes com um segmento ST elevado de infarto do miocárdio. No entanto, reperfusão por si pode resultar em mais casos de morte, um fenômeno conhecido como lesão de reperfusão. A abertura do poro de transição de permeabilidade mitocondrial (mPTP), com a diminuição do potencial de membrana mitocondrial (MMP), ou despolarização mitocondrial, é universalmente reconhecida como a etapa final da lesão de reperfusão e é responsável por mitocondrial e casos de morte. JC-1 é um corante lipofílico catiônico que se acumula nas mitocôndrias, dependendo do valor da MMP. Quanto maior o MMP é, quanto mais JC-1 acumula-se nas mitocôndrias. As quantidades crescentes de JC-1 na mitocôndria podem ser refletidas por uma mudança de emissão de fluorescência do verde (~ 530 nm) ao vermelho (~ 590 nm). Portanto, a redução do rácio da intensidade de fluorescência vermelha/verde pode indicar a despolarização da mitocôndria. Aqui, levamos vantagem do JC-1 para medir MMP, ou a abertura do mPTP em miócitos humanos após hipóxia/reoxigenação, detectada por citometria de fluxo.

Introdução

Doença coronariana é a principal causa de morte no mundo. O tratamento de escolha para reduzir lesões isquêmicas e limitar o tamanho do infarto em pacientes com ST-segmento elevados do miocárdio é oportuna e eficaz de reperfusão miocárdica através de intervenção coronária percutânea primária (PCI)^{1, 2}. No entanto, a reperfusão causa dano adicional, que pode representar até 30% do tamanho final de infarto³. É universalmente reconhecido que o poro de transição de permeabilidade mitocondrial (mPTP) não é apenas central na morte de danos e célula mitocondrial durante a isquemia/reperfusão ....

Protocolo

1. preparação de reagentes e soluções

1. Prepare meio completo humano miócitos (HCMs) adicionando-se 25 mL de mistura de suplemento miócito crescimento médio de 500 mL do meio de crescimento do miócito conforme as instruções do fabricante. Loja a 4 ° C e aquecer a 37 ° C antes de usar.
2. Preparar a solução de Tongxinluo (TXL) pela dissolução TXL pó ultrafino em soro/glicose-livre de Dulbecco modificado médio da águia (DMEM) e ajustar a concentração de TXL a 400 µ g/mL, adicionando DMEM (para mais detalhes, ver¹¹). Loja a 4 ° C e aquecer a 37 ° C antes de usar.
3. Prepare-se 5 mL da solução de trabalho de JC-1 adicionando 2....

Resultados

Antes de realizar o ensaio de JC-1 para avaliar as alterações de MMP, é altamente recomendável que ser realizados experimentos confirmar as condições com êxito definido pelos pesquisadores. Como mostram os resultados de citometria de fluxo (Figura 2), em comparação com o grupo normal, hipóxia/reoxigenação (H/R) significativamente induziu a apoptose de HCMs (anexina V + /PI±), indicando que nós tinha estabelecido um modelo baseado em pilha de I / R (45.00 ± 2,.......

Discussão

Aqui, apresentamos um protocolo que utiliza o corante de JC-1 para avaliar a MMP das células após serem expostos a H/R. detectadas pelo ensaio de JC-1, o MMP de células independe de fatores como tamanho mitocondrial, forma e densidade que possam influenciar a fluorescência do único-componente sinais de¹⁴. Consequentemente, os resultados do ensaio de JC-1 são relativamente confiáveis. Além disso, é conveniente e economia de tempo para realizar o ensaio de JC-1. Este ensaio tem uma baixa exigência p.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Kit de ensaio de potencial de membrana mitocondrial com JC-1	Beyodtime, China	C2006	No kit há solução de estoque JC-1 (200 &vezes;), tampão de coloração de estoque (5&vezes;) e pó ultrafino CCCP (10mM)
Tongxinluo	Shijiazhuang Yiling Pharmaceutical Co., China	071201
Anexina V-FITC/PI Kit	Becton-Dickinson, EUA	556547
DMEM	Life Technologies, Grand Island Biological Company, EUA	11966-025
Miócitos cardíacos humanos	Promocell, Alemanha	C-12810
Meio de crescimento de miócitos (SupplementMix)	Promocell, Alemanha	C-39275
Meio de crescimento de miócitos (pronto para uso)	Promocell, Alemanha	C-22070	usado com meio de crescimento de miócitos SupplementMix
GENbox	BioMé rieux, Marcy l' Etoile, França	96127	Catalisador 2.5L
(AnaeroPack)	MITSUBISHI GAS CHEMICAL  COMPANY, INC. , Japão	C-1
Indicador anaeróbico	BioMé rieux, Marcy l' Etoile, França	96118
Citômetro de fluxo	Becton-Dickinson, EUA	FACSAria 2
BD FACSDiva Software	Becton-Dickinson, EUA		Versão 8.0.1
Tubo de amostra	Corning science, EUA	352054	12 * 75mm
PBS	Hyclone, EUA	SH30256.01