Un'analisi basata su citometria a flusso per misurare il potenziale di membrana mitocondriale in miociti cardiaci dopo ipossia/riossigenazione
Summary
Qui, presentiamo un protocollo che utilizza la tintura JC-1 per valutare il potenziale di membrana mitocondriale delle cellule dopo l’esposizione all’ipossia/riossigenazione con o senza un agente protettivo.
Abstract
Tempestivo ed efficace riperfusione dell’arteria coronaria occlusa è la migliore strategia per ridurre la dimensione di infarto del miocardio in pazienti con un segmento ST elevato di infarto miocardico. Tuttavia, riperfusione di per sé può provocare ulteriore del cardiomyocyte, un fenomeno noto come lesione di riperfusione. L’apertura del poro di transizione di permeabilità mitocondriale (mPTP), con la diminuzione del potenziale di membrana mitocondriale (MMP), o la depolarizzazione mitocondriale, è universalmente riconosciuto come il passaggio finale di riperfusione ed è responsabile mitocondriale e morte dei cardiomiociti. JC-1 è una tintura cationica lipofilica che si accumula in mitocondri a seconda del valore di MMP. Più alto è il MMP, più JC-1 si accumula nei mitocondri. La quantità crescente di JC-1 in mitocondri può essere riflessa da uno spostamento di emissione di fluorescenza da verde (~ 530 nm) al rosso (~ 590 nm). Quindi, la riduzione del rapporto dell’intensità di fluorescenza rosso/verde può indicare la depolarizzazione dei mitocondri. Qui, prendiamo vantaggio di JC-1 per misurare MMP, o l’apertura di mPTP in miociti cardiaci umani dopo ipossia/riossigenazione, rilevato tramite flusso cytometry.
Introduction
Malattia coronarica è la principale causa di morte in tutto il mondo. Il trattamento della scelta per ridurre la lesione ischemica e limitando la dimensione di infarto in pazienti con ST-segmento elevato l’infarto miocardico è tempestiva ed efficace riperfusione miocardica via primaria intervento coronarico percutaneo (PCI)1, 2. Tuttavia, riperfusione determina danni aggiuntivi, che possono rappresentare fino al 30% della dimensione finale infarto3. È universalmente riconosciuto che il poro di transizione di permeabilità mitocondriale (mPTP) non è solo centrale nella morte delle cellule e danno mitocondriale durante ischemia/riperfusione (I / R), ma è anche un obiettivo convergente di cardioprotective segnalazione4 , 5. come l’apertura di mPTP porterebbe a depolarizzazione della membrana mitocondriale interna potenziali (MMP)4, abbiamo rilevato mPTP apertura utilizzando 5, 5 ‘, 6, 6 ‘-Tetrachloro-1, 1 ′, 3, 3 ‘-tetraetile-imidacarbocyanineiodide (JC-1) dosaggio.
L’analisi di JC-1 è un metodo di citofluorimetria che è sia qualitativa che quantitativa, e che è stato ulteriormente convalidato analizzando le MMP al livello di un singolo mitocondri6. JC-1 esiste come forma aggregata, producendo un colore rosso a emissione colorata arancione (590 nm ± 17,5) nella matrice dei mitocondri con MMP normale; con la perdita di MMP, JC-1 viene convertito in forma monomerica che produce fluorescenza verde con un’emissione di 530 ± 15 nm. Di conseguenza, una diminuzione nel rapporto di intensità della fluorescenza rosso/verde potrebbe indicare la riduzione delle MMP in condizioni quali l’ischemia/riperfusione (I / R).
Oltre a JC-1, MMP è stato anche studiato con membrana permeabile cationi lipofilici quali rodamina 123 e 3, 3 ‘-dihexyloxadicarbocyanine ioduro [DiOC6(3)]. Tuttavia, rispetto a queste due sonde, JC-1 è più affidabile per l’analisi di MMP. Rodamina 123 ha relativamente scarsa sensibilità (soprattutto in tempra modalità7,8) e scarsa specificità. Lo spostamento in rodamina 123 a volte è così piccolo che è difficile per i ricercatori o attrezzature osservare/rilevare. Inoltre, in una singola cella, ci sono siti di legame del mitocondrio differenti per rodamina 123 e così che esso può avere fluorescenza diverse emissioni9. DiOC6(3) non è raccomandato per la rilevazione di MMP o come reagisce in maniera sensibile per la depolarizzazione della membrana plasmatica10.
Pertanto, qui usiamo l’analisi di JC-1 per valutare il MMP di HCMs dopo essere stati esposti ad ipossia/riossigenazione con o senza un agente protettivo.
Protocol
Representative Results
Discussion
Qui, presentiamo un protocollo che utilizza la tintura JC-1 per valutare il MMP delle cellule dopo essere stati esposti per H/R. rilevato dall’analisi di JC-1, MMP delle cellule è indipendente da fattori quali dimensione mitocondriale, forma e densità che possono influenzare la fluorescenza di singolo-componente segnali di14. Di conseguenza, i risultati dell’analisi di JC-1 sono relativamente affidabili. Inoltre, è conveniente e risparmio di tempo per eseguire l’analisi di JC-1. Questo test ha …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo studio è stato sostenuto da sovvenzioni da The National Key Research e programma di sviluppo della Cina (n. 2017YFC1700503), il programma nazionale di ricerca base (973 programma) della Cina (No.2012CB518602), National Natural Science Foundation of China (No. 81370223 e no. 81573957) e la Fondazione di ricerca innovativa degli specializzandi del Peking Union Medical College (2016-1002-01-02).
Materials
| Mitochondrial membrane potential assay kit with JC-1 | Beyodtime, China | C2006 | In the kit there are JC-1 stock solution (200×), stock staining buffer (5×) and CCCP(10mM) |
| Tongxinluo ultrafine powder | Shijiazhuang Yiling Pharmaceutical Co., China | 071201 | |
| Annexin V-FITC/PI Kit | Becton-Dickinson, USA | 556547 | |
| DMEM | Life Technologies, Grand Island Biological Company, USA | 11966-025 | |
| Human cardiac myocyte | Promocell, Germany | C-12810 | |
| Myocyte Growth Medium (SupplementMix) |
Promocell, Germany | C-39275 | |
| Myocyte Growth Medium (Ready-to-use) | Promocell, Germany | C-22070 | used with Myocyte Growth Medium SupplementMix |
| GENbox | BioMérieux, Marcy l’Etoile, France | 96127 | 2.5L |
| Catalyst (AnaeroPack) | MITSUBISHI GAS CHEMICAL COMPANY, INC. , Japan | C-1 | |
| Anaerobic indicator | BioMérieux, Marcy l’Etoile, France | 96118 | |
| Flow cytometer | Becton-Dickinson, USA | FACSAria 2 | |
| BD FACSDiva Software | Becton-Dickinson, USA | Version8.0.1 | |
| Sample tube | Corning science, USA | 352054 | 12*75mm |
| PBS | Hyclone, USA | SH30256.01 |
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