低酸素/再酸素化後心筋細胞におけるミトコンドリア膜電位を測定するためのフロー フローサイトメトリーを用いたアッセイ
Summary
ここでは、JC 1 染料を使用して保護エージェントの有無を低酸素/再酸素化にさらされた後細胞のミトコンドリア膜電位を評価するプロトコルを提案する.
Abstract
閉塞した冠動脈のタイムリーかつ効率的な再灌流は、ST セグメント患者における心筋梗塞サイズを減らすための最善の戦略は、心筋梗塞を高架です。ただし、さらに心筋細胞死、再灌流障害として知られている現象で発生することができます再灌流自体。ミトコンドリア膜電位の低下 (MMP)、またはミトコンドリア脱分極とミトコンドリア膜透過性遷移孔 (mPTP) の開口部は再灌流障害の最後のステップとして、広く認められてを担当ミトコンドリアと心筋細胞死。JC 1 は MMP の値によってミトコンドリアに蓄積される脂溶性カチオン染料です。MMP が高いより JC 1 はミトコンドリアに蓄積されます。緑からの蛍光発光シフトによるミトコンドリアの JC 1 の増加量を反映できる (~ 530 nm) 赤 (~ 590 nm)。したがって、赤/緑の蛍光強度比の低減は、ミトコンドリアの脱分極を示すことができます。ここでは、我々 は MMP を測定する JC 1 の利点やフローサイトメトリーによる検出に再酸素化低酸素後のヒトの心筋細胞における mPTP の開口部を取る。
Introduction
冠動脈心疾患は、死の世界の主要な原因です。治療の選択肢の虚血性損傷を減らすことと st 患者の梗塞サイズを制限する心筋梗塞を高架は via 初回経皮的冠動脈インターベンション (PCI)1、タイムリーかつ効果的な心筋再灌流 2。ただし、再灌流は、最終梗塞サイズ3の 30% までを占めることができます追加の損傷を引き起こします。それは普遍的にミトコンドリア膜透過性遷移孔 (mPTP) がだけ虚血/再灌流時のミトコンドリアの損傷および細胞死の中心ではないことを認めたが (私/R)、心保護4信号の収束先ではまた,5. mPTP 開口部は内部のミトコンドリア膜電位 (MMP)4の脱分極もたらす、我々 検出 5, 5 ‘, を用いた mPTP 開口 1 ‘6’-テトラクロロ-m–1、6、3、3 ‘-エチル-imidacarbocyanineiodide (JC 1) 試金。
JC 1 アッセイは、定性と定量は、cytofluorimetric メソッドと単一ミトコンドリア6のレベルで MMP を分析することによってさらに検証されています。オレンジ色発光 (590 ± 17.5 nm) マトリックスで通常 MMP; とミトコンドリアの赤を産する集計形式として存在する JC 1MMP の損失と JC 1 は 530 ± 15 nm の発光と蛍光グリーンを生成する単量体のフォームに変換されます。したがって、赤/緑の蛍光強度比の減少は、虚血/再灌流などの条件で MMP の削減可能性 (私/R)。
JC-1 に加え MMP もローダミン 123 と 3, 3 ‘-dihexyloxadicarbocyanine ヨウ化 [DiOC6(3)] など脂溶性陽イオン膜透過性と研究されています。しかし、これらの 2 つのプローブと比較して、JC 1 MMP の分析信頼性の高いものです。ローダミン 123 (特にモード7、8を焼入) で比較的貧しい感度と貧しい人々 の特異性があります。ローダミン 123 のシフトは時々 観察検出する研究者または機器のハードが非常に小さいです。以外にも、単一のセルにローダミン 123 の異なるミトコンドリア結合部位がある、だからそれは、異なる蛍光排出量9を必要があります。DiOC6(3) は MMP を検出するためお勧めできませんのいずれかとして、それは血しょう膜10の脱分極に敏感に反応します。
したがって、ここで我々 は保護剤の有無を低酸素/再酸素化にさらされた後 HCMs MMP を評価するために JC 1 アッセイを使用します。
Protocol
Representative Results
Discussion
ここでは、JC 1 染料を使用して JC 1 アッセイによって H/r. 検出にさらされた後細胞の MMP を評価するプロトコルを提案する、セルの MMP はミトコンドリアのサイズ、形状、および単一成分蛍光に影響を及ぼすかもしれない密度などの要因から独立して14をを信号します。したがって、JC 1 アッセイの結果は比較的信頼性の高いです。その上、それは、便利で JC 1 分析を実行する…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、国立キー研究と開発中国プログラム (第 2017YFC1700503) からの補助金によって支えられた国家の基本的な研究プログラム (973 プログラム) 中国 (No.2012CB518602)、中国の国家自然科学基金 (号 81370223号 81573957)、北京連合医学の大学 (2016-1002-01-02) の院生の革新的な研究財団。
Materials
| Mitochondrial membrane potential assay kit with JC-1 | Beyodtime, China | C2006 | In the kit there are JC-1 stock solution (200×), stock staining buffer (5×) and CCCP(10mM) |
| Tongxinluo ultrafine powder | Shijiazhuang Yiling Pharmaceutical Co., China | 071201 | |
| Annexin V-FITC/PI Kit | Becton-Dickinson, USA | 556547 | |
| DMEM | Life Technologies, Grand Island Biological Company, USA | 11966-025 | |
| Human cardiac myocyte | Promocell, Germany | C-12810 | |
| Myocyte Growth Medium (SupplementMix) |
Promocell, Germany | C-39275 | |
| Myocyte Growth Medium (Ready-to-use) | Promocell, Germany | C-22070 | used with Myocyte Growth Medium SupplementMix |
| GENbox | BioMérieux, Marcy l’Etoile, France | 96127 | 2.5L |
| Catalyst (AnaeroPack) | MITSUBISHI GAS CHEMICAL COMPANY, INC. , Japan | C-1 | |
| Anaerobic indicator | BioMérieux, Marcy l’Etoile, France | 96118 | |
| Flow cytometer | Becton-Dickinson, USA | FACSAria 2 | |
| BD FACSDiva Software | Becton-Dickinson, USA | Version8.0.1 | |
| Sample tube | Corning science, USA | 352054 | 12*75mm |
| PBS | Hyclone, USA | SH30256.01 |
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