Um ensaio de baseados em citometria de fluxo para medir o potencial de membrana mitocondrial em miócitos após hipóxia/reoxigenação
Summary
Aqui, apresentamos um protocolo que usa JC-1 tintura para avaliar o potencial de membrana mitocondrial das células após serem expostos a hipóxia/reoxigenação com ou sem um agente protetor.
Abstract
Oportuna e eficiente de reperfusão da artéria coronária obstruída é a melhor estratégia para diminuir o tamanho do infarto do miocárdio em pacientes com um segmento ST elevado de infarto do miocárdio. No entanto, reperfusão por si pode resultar em mais casos de morte, um fenômeno conhecido como lesão de reperfusão. A abertura do poro de transição de permeabilidade mitocondrial (mPTP), com a diminuição do potencial de membrana mitocondrial (MMP), ou despolarização mitocondrial, é universalmente reconhecida como a etapa final da lesão de reperfusão e é responsável por mitocondrial e casos de morte. JC-1 é um corante lipofílico catiônico que se acumula nas mitocôndrias, dependendo do valor da MMP. Quanto maior o MMP é, quanto mais JC-1 acumula-se nas mitocôndrias. As quantidades crescentes de JC-1 na mitocôndria podem ser refletidas por uma mudança de emissão de fluorescência do verde (~ 530 nm) ao vermelho (~ 590 nm). Portanto, a redução do rácio da intensidade de fluorescência vermelha/verde pode indicar a despolarização da mitocôndria. Aqui, levamos vantagem do JC-1 para medir MMP, ou a abertura do mPTP em miócitos humanos após hipóxia/reoxigenação, detectada por citometria de fluxo.
Introduction
Doença coronariana é a principal causa de morte no mundo. O tratamento de escolha para reduzir lesões isquêmicas e limitar o tamanho do infarto em pacientes com ST-segmento elevados do miocárdio é oportuna e eficaz de reperfusão miocárdica através de intervenção coronária percutânea primária (PCI)1, 2. No entanto, a reperfusão causa dano adicional, que pode representar até 30% do tamanho final de infarto3. É universalmente reconhecido que o poro de transição de permeabilidade mitocondrial (mPTP) não é apenas central na morte de danos e célula mitocondrial durante a isquemia/reperfusão (eu / R), mas é também um destino convergente do cardioprotetores sinalização4 , 5. como a abertura do mPTP acarretaria a despolarização da membrana mitocondrial interna potencial (MMP)4, detectamos mPTP abertura usando o 5, 5, 6, 6 ‘-tetracloro-1, 1, 3, 3 ‘-tetraetil-imidacarbocyanineiodide (JC-1) do ensaio.
O ensaio de JC-1 é um método de cytofluorimetric que é tanto qualitativas como quantitativas, e foi validado mais analisando o MMP ao nível de uma única mitocôndria6. JC-1 existe como forma agregada, rendendo um vermelho a laranja colorida de emissão (590 ± 17.5 nm) na matriz da mitocôndria com MMP normal; com a perda de MMP, JC-1 é convertido para a forma monomérica que produz fluorescência verde com uma emissão de 530 nm ± 15. Portanto, uma diminuição do rácio de intensidade de fluorescência vermelha/verde pode indicar a redução de MMP em condições tais como isquemia/reperfusão (eu / R).
Além de JC-1, MMP também tem sido estudada com membrana permeável cações lipofílicas como Rodamina 123 e 3, 3 ‘-dihexyloxadicarbocyanine iodeto [DiOC6(3)]. No entanto, em comparação com estas duas sondas, JC-1 é mais confiável para a análise de MMP. Rodamina 123 tem sensibilidade relativamente pobre (especialmente em têmpera de7,de modo8) e especificidade de pobre. A mudança de rodamina 123 às vezes é tão pequena que é difícil para os pesquisadores ou equipamento para observar/detectar. Além disso, em uma única célula, existem sites de ligação diferentes mitocôndria para Rodamina 123 e assim que ele pode ter fluorescência diferentes emissões9. DiOC6(3) não é recomendado para a detecção de MMP também como ele reage com sensibilidade para a despolarização da membrana plasmática10.
Portanto, aqui vamos usar o JC-1 ensaio para avaliar a MMP de HCMs após serem expostos a hipóxia/reoxigenação com ou sem um agente protetor.
Protocol
Representative Results
Discussion
Aqui, apresentamos um protocolo que utiliza o corante de JC-1 para avaliar a MMP das células após serem expostos a H/R. detectadas pelo ensaio de JC-1, o MMP de células independe de fatores como tamanho mitocondrial, forma e densidade que possam influenciar a fluorescência do único-componente sinais de14. Consequentemente, os resultados do ensaio de JC-1 são relativamente confiáveis. Além disso, é conveniente e economia de tempo para realizar o ensaio de JC-1. Este ensaio tem uma baixa ex…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este estudo foi suportado por concessões do nacional a chave de pesquisa e programa de desenvolvimento da China (n. º 2017YFC1700503), programa nacional de pesquisa básica (programa 973) da China (No.2012CB518602), a Fundação Nacional de ciências naturais da China (n. º 81370223 e n. º 81573957) e Fundação de pesquisas inovadoras dos pós-graduados a de Peking Union Medical College (2016-1002-01-02).
Materials
| Mitochondrial membrane potential assay kit with JC-1 | Beyodtime, China | C2006 | In the kit there are JC-1 stock solution (200×), stock staining buffer (5×) and CCCP(10mM) |
| Tongxinluo ultrafine powder | Shijiazhuang Yiling Pharmaceutical Co., China | 071201 | |
| Annexin V-FITC/PI Kit | Becton-Dickinson, USA | 556547 | |
| DMEM | Life Technologies, Grand Island Biological Company, USA | 11966-025 | |
| Human cardiac myocyte | Promocell, Germany | C-12810 | |
| Myocyte Growth Medium (SupplementMix) |
Promocell, Germany | C-39275 | |
| Myocyte Growth Medium (Ready-to-use) | Promocell, Germany | C-22070 | used with Myocyte Growth Medium SupplementMix |
| GENbox | BioMérieux, Marcy l’Etoile, France | 96127 | 2.5L |
| Catalyst (AnaeroPack) | MITSUBISHI GAS CHEMICAL COMPANY, INC. , Japan | C-1 | |
| Anaerobic indicator | BioMérieux, Marcy l’Etoile, France | 96118 | |
| Flow cytometer | Becton-Dickinson, USA | FACSAria 2 | |
| BD FACSDiva Software | Becton-Dickinson, USA | Version8.0.1 | |
| Sample tube | Corning science, USA | 352054 | 12*75mm |
| PBS | Hyclone, USA | SH30256.01 |
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