Un análisis basado en la citometría de flujo para medir el potencial de membrana mitocondrial en miocitos cardiacos después de hipoxia/Reoxygenation
Summary
Aquí, presentamos un protocolo que utiliza tinte JC-1 para evaluar el potencial de membrana mitocondrial de las células después de ser expuestos a hipoxia/reoxygenation con o sin un agente protector.
Abstract
Oportuna y eficiente la reperfusión de la arteria coronaria ocluida es la mejor estrategia para disminuir el tamaño del infarto miocardio en pacientes con un segmento ST elevado de infarto de miocardio. Sin embargo, la reperfusión por sí puede provocar más muerte de cardiomiocitos, un fenómeno conocido como lesión de la reperfusión. La apertura del poro de transición de la permeabilidad mitocondrial (mPTP), con la disminución del potencial de membrana mitocondrial (MMP), o la despolarización mitocondrial, es reconocida universalmente como el paso final de daño por reperfusión y es responsable de mitocondrial y de la muerte de los cardiomiocitos. JC-1 es un colorante catiónico lipofílico que se acumula en las mitocondrias dependiendo del valor de MMP. Cuanto más alto es el MMP, más JC-1 se acumula en la mitocondria. Las crecientes cantidades de JC-1 en la mitocondria pueden ser reflejadas por un cambio de emisión de fluorescencia verde (~ 530 nm) a rojo (~ 590 nm). Por lo tanto, la reducción de la relación de intensidad de fluorescencia roja/verde puede indicar la despolarización de las mitocondrias. Aquí, tomamos ventaja de JC-1 para medir la MMP o la apertura del mPTP en miocitos cardiacos humanos después de la hipoxia/reoxygenation, detectado mediante citometría de flujo.
Introduction
Enfermedad coronaria es la principal causa de muerte en todo el mundo. El tratamiento de elección para reducir lesión isquémica y limitar el tamaño del infarto en pacientes con segmento ST elevan de infarto de miocardio es oportuna y eficaz la reperfusión miocárdica mediante intervención coronaria percutánea (ICP) primaria1, 2. Sin embargo, la reperfusión causa daño adicional, que puede suponer hasta un 30% del tamaño final del infarto3. Se reconoce universalmente que el poro de transición de permeabilidad mitocondrial (mPTP) no es sólo central en mitocondrial daño y muerte celular durante la isquemia/reperfusión (me / R), pero es también un objetivo convergente de cardioprotectores señalización4 , 5. como la apertura del mPTP traería sobre la despolarización de la membrana mitocondrial interna potencial (MMP)4, detectamos la apertura del mPTP usando el 5, 5, 6, 6 ‘-Tetrachloro-1, 1, 3, 3′-Tetraetil-imidacarbocyanineiodide (JC-1) ensayo.
El ensayo de JC-1 es un método cytofluorimetric que es cualitativa y cuantitativa, y ha sido validado mediante el análisis de la MMP en el nivel de una sola mitocondria6. JC-1 existe como un agregado, rindiendo un rojo a emisión color naranja (590 ± 17,5 nm) en la matriz de la mitocondria con MMP normal; con la pérdida de MMP, JC-1 se convierte en la forma monomérica que produce fluorescencia verde con una emisión de 530 nm ± 15. Por lo tanto, una disminución en el cociente de la intensidad de fluorescencia roja/verde podría indicar la reducción de MMP en condiciones como la isquemia/reperfusión (me / R).
Además de JC-1, MMP también se ha estudiado con membrana permeable cationes lipofílicos como rodamina 123 y 3, 3′ dihexyloxadicarbocyanine yoduro [DiOC6(3)]. Sin embargo, en comparación con estas dos sondas, JC-1 es más confiable para el análisis de MMP. Rodamina 123 tiene sensibilidad relativamente pobre (especialmente en modo7,8de amortiguamiento) y la pobre especificidad. El cambio en rodamina 123 a veces es tan pequeño que es difícil para los investigadores o equipos para observar/detectar. Además, en una sola célula, existen sitios de Unión diferentes mitocondrias de rodamina 123 y así ello tenga fluorescencia diferentes emisiones9. DiOC6(3) no se recomienda para la detección de MMP o como reacciona sensiblemente a la despolarización de la membrana plasmática10.
Por lo tanto, aquí utilizamos el JC-1 ensayo para evaluar la MMP de HCMs después de ser expuestos a hipoxia/reoxygenation con o sin un agente protector.
Protocol
Representative Results
Discussion
Aquí, presentamos un protocolo que utiliza tinte JC-1 para evaluar la MMP de células después de estar expuesto a H/R. detectado por análisis de JC-1, MMP de células es independiente de factores tales como tamaño mitocondrial, forma y densidad que puede influir en la fluorescencia del solo-componente señales de14. En consecuencia, los resultados del ensayo de JC-1 son relativamente confiables. Además, es conveniente y ahorro de tiempo para realizar el ensayo de JC-1. Este ensayo tiene un re…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este estudio fue apoyado por becas de la investigación clave nacional y programa de desarrollo de China (Nº 2017YFC1700503), el programa nacional de investigación básica (programa 973) de China (No.2012CB518602), la Fundación Nacional de Ciencias naturales de China (no. 81370223 y Nº 81573957) y la Fundación de investigación innovadora de los postgrados de Peking Union Medical College (2016-1002-01-02).
Materials
| Mitochondrial membrane potential assay kit with JC-1 | Beyodtime, China | C2006 | In the kit there are JC-1 stock solution (200×), stock staining buffer (5×) and CCCP(10mM) |
| Tongxinluo ultrafine powder | Shijiazhuang Yiling Pharmaceutical Co., China | 071201 | |
| Annexin V-FITC/PI Kit | Becton-Dickinson, USA | 556547 | |
| DMEM | Life Technologies, Grand Island Biological Company, USA | 11966-025 | |
| Human cardiac myocyte | Promocell, Germany | C-12810 | |
| Myocyte Growth Medium (SupplementMix) |
Promocell, Germany | C-39275 | |
| Myocyte Growth Medium (Ready-to-use) | Promocell, Germany | C-22070 | used with Myocyte Growth Medium SupplementMix |
| GENbox | BioMérieux, Marcy l’Etoile, France | 96127 | 2.5L |
| Catalyst (AnaeroPack) | MITSUBISHI GAS CHEMICAL COMPANY, INC. , Japan | C-1 | |
| Anaerobic indicator | BioMérieux, Marcy l’Etoile, France | 96118 | |
| Flow cytometer | Becton-Dickinson, USA | FACSAria 2 | |
| BD FACSDiva Software | Becton-Dickinson, USA | Version8.0.1 | |
| Sample tube | Corning science, USA | 352054 | 12*75mm |
| PBS | Hyclone, USA | SH30256.01 |
Referências
- Anderson, J. L., Morrow, D. A. Acute Myocardial Infarction. New England Journal of Medicine. 376 (21), 2053-2064 (2017).
- Ibanez, B., et al. ESC Guidelines for the management of acute myocardial infarction in patients presenting with ST-segment elevation: The Task Force for the management of acute myocardial infarction in patients presenting with ST-segment elevation of the European Society of Cardiology (ESC). European Heart Journal. 39 (2), 119-177 (2017).
- Yellon, D. M., Hausenloy, D. J. Myocardial reperfusion injury. New England Journal of Medicine. 357 (11), 1121-1135 (2007).
- Ong, S. B., Samangouei, P., Kalkhoran, S. B., Hausenloy, D. J. The mitochondrial permeability transition pore and its role in myocardial ischemia reperfusion injury. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 78, 23-34 (2015).
- Heusch, G. Molecular basis of cardioprotection: signal transduction in ischemic pre-, post-, and remote conditioning. Circulation Research. 116 (4), 674-699 (2015).
- Cossarizza, A., Ceccarelli, D., Masini, A. Functional heterogeneity of an isolated mitochondrial population revealed by cytofluorometric analysis at the single organelle level. Experimental Cell Research. 222 (1), 84-94 (1996).
- Ward, M. W., Rego, A. C., Frenguelli, B. G., Nicholls, D. G. Mitochondrial membrane potential and glutamate excitotoxicity in cultured cerebellar granule cells. Journal of Neuroscience. 20 (19), 7208-7219 (2000).
- Perry, S. W., Norman, J. P., Barbieri, J., Brown, E. B., Gelbard, H. A. Mitochondrial membrane potential probes and the proton gradient: a practical usage guide. Biotechniques. 50 (2), 98-115 (2011).
- Cossarizza, A., Salvioli, S. Flow cytometric analysis of mitochondrial membrane potential using JC-1. Current Protocols in Cytometry. , 14 (2001).
- Salvioli, S., Ardizzoni, A., Franceschi, C., Cossarizza, A. JC-1, but not DiOC6(3) or rhodamine 123, is a reliable fluorescent probe to assess delta psi changes in intact cells: implications for studies on mitochondrial functionality during apoptosis. FEBS Letters. 411 (1), 77-82 (1997).
- Chen, G. H., et al. Inhibition of miR-128-3p by Tongxinluo Protects Human Cardiomyocytes from Ischemia/reperfusion Injury via Upregulation of p70s6k1/p-p70s6k1. Frontiers in Pharmacology. 8, 775 (2017).
- Cui, H., et al. Induction of autophagy by Tongxinluo through the MEK/ERK pathway protects human cardiac microvascular endothelial cells from hypoxia/reoxygenation injury. Journal of Cardiovascular Pharmacology. 64 (2), 180-190 (2014).
- Chen, J., et al. Lysophosphatidic acid protects mesenchymal stem cells against hypoxia and serum deprivation-induced apoptosis. Stem Cells. 26 (1), 135-145 (2008).
- Chazotte, B. Labeling mitochondria with JC-1. Cold Spring Harbor Protocols. (9), (2011).
- Pravdic, D., et al. Anesthetic-induced preconditioning delays opening of mitochondrial permeability transition pore via protein Kinase C-epsilon-mediated pathway. Anesthesiology. 111 (2), 267-274 (2009).
- Wu, Y., et al. Suppression of Excessive Histone Deacetylases Activity in Diabetic Hearts Attenuates Myocardial Ischemia/Reperfusion Injury via Mitochondria Apoptosis Pathway. Journal of Diabetes Research. 2017, 8208065 (2017).
- Qiu, Y., et al. Curcumin-induced melanoma cell death is associated with mitochondrial permeability transition pore (mPTP) opening. Biochemical and Biophysical Research Communications. 448 (1), 15-21 (2014).
- Zhen, Y. F., et al. P53 dependent mitochondrial permeability transition pore opening is required for dexamethasone-induced death of osteoblasts. Journal of Cell Physiology. 229 (10), 1475-1483 (2014).
- Nazarewicz, R. R., Dikalova, A. E., Bikineyeva, A., Dikalov, S. I. Nox2 as a potential target of mitochondrial superoxide and its role in endothelial oxidative stress. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 305 (8), H1131-H1140 (2013).
- Wang, T., Zhang, Z. X., Xu, Y. J. Effect of mitochondrial KATP channel on voltage-gated K+ channel in 24 hour-hypoxic human pulmonary artery smooth muscle cells. Chinese Medical Journal (Engl). 118 (1), 12-19 (2005).
- Kuter, N., Aysit-Altuncu, N., Ozturk, G., Ozek, E. The Neuroprotective Effects of Hypothermia on Bilirubin-Induced Neurotoxicity in vitro. Neonatology. 113 (4), 360-365 (2018).
- Zheng, Y. Y., Wang, M., Shu, X. B., Zheng, P. Y., Ji, G. Autophagy activation by Jiang Zhi Granule protects against metabolic stress-induced hepatocyte injury. World Journal of Gastroenterology. 24 (9), 992-1003 (2018).
- El Gamal, H., Eid, A. H., Munusamy, S. Renoprotective Effects of Aldose Reductase Inhibitor Epalrestat against High Glucose-Induced Cellular Injury. Biomed Research International. 2017, 5903105 (2017).
- Renault, T. T., Luna-Vargas, M. P., Chipuk, J. E. Mouse Liver Mitochondria Isolation, Size Fractionation, and Real-time MOMP Measurement. Bio-Protocols. 6 (15), (2016).
