진 핵 생물의 전사 오류의 게놈 넓은 감시
Summary
이 프로토콜 여러 모델 생물에서 녹음의 품질을 모니터링 하는 새로운 도구와 연구를 제공 합니다.
Abstract
정확한 전사는 유전 정보의 충실 한 식에 대 한 필요 합니다. 놀랍게도 하지만, 약간 녹음의 품질을 제어 하는 메커니즘에 대 한 알려져 있다. 과학적 지식에이 격차를 채우기 위해 우리는 최근 Saccharomyces cerevisiae, 초파리 melanogaster, 및 꼬마 transcriptome 걸쳐 전사 오류를 감지 하 원-시퀀싱 분석 결과 최적화 선 충. 이 프로토콜은 전사 오류 진 핵 세포에서의 전사의 품질을 제어 하는 메커니즘 전례 없는 자세히 해명 될 수 있도록 지도 하는 강력한 새로운 도구와 연구를 제공할 것입니다.
Introduction
게놈 생명의 정확한 생물학 청사진을 제공합니다. 이 청사진을 제대로 구현 하기 좋은 정밀도로 변하게 하는 게놈에 대 한 중요 하다. 그러나, 전사 무료 오류일 가능성이 크다. 예를 들어 RNA polymerases 오류가 시험관에1,2, 하 긴 알려져 있다 그리고 최근에 그들은 오류에서 vivo에서 뿐만 아니라3,,56, 커밋 보였다 DNA에 직면 하는 경우에 특히7,8,,910손상. 함께 찍은, 이러한 관측은 필 사 오류가 발생 지속적으로 모든 살아있는 세포에서 그들은 돌연변이 단백질의 강력한 원천이 될 수 있는 제안 나타냅니다.
Transcriptional mutagenesis 되 나,이 과정에서 두 가지 방법으로 고전 mutagenesis 다릅니다. 첫째, 유전자 변이, 달리 전사 오류 영향을 mitotic 그리고 포스트 mitotic 세포로 DNA 복제에 의존 하지 않는. 전사의 품질에 영향을 주는 메커니즘을 공부 mitotic 그리고 포스트 mitotic 세포의 돌연변이 부하에 대 한 값진 통찰력 제공 따라서. 흥미롭게도, 전사 오류 최근 단백질 집계11,,1213 의 승진에 연루 되어 고 모두 발암10 에 기여할 가설과 항생제 저항 박테리아14의 개발.
둘째, 유전자 변이, 달리 필 사 오류는 자연에 과도. 그들의 임시 존재 하기 때문에 전송 오류 검출 하기 상당히 어려운 특히 도전 이다. 예를 들어 여러 실험실 transcriptional mutagenesis 연구에 대 한 귀중 한 기자가 분석 실험을 고안 했다, 하는 동안 이러한 분석 전사 오류 컨텍스트 및 모델 생물4,15의 한정된 된 수에서 측정 수만 있습니다. 이러한 한계를 극복 하기 위해 많은 연구 자들은 RNA 시퀀싱 기술 (RNA-seq), 이론적으로 모든 종의 transcriptome 걸쳐 기록 전사 오류를 수 있는 게 아닙니다. 그러나, 이러한 연구는 반전 녹음 방송 오류, PCR 증폭 오류 등 자체 시퀀싱의 오류가 자연 도서관 건축 유물에 의해 쉽게 혼동 된다. 예를 들어 역 transcriptases 커밋 약 한 오류 모든 ~ 20000 기지 동안 RNA polymerases (RNAPs) 하나의 실수 모든 300000 기지5,6것으로 예상 된다. 반전 녹음 방송 혼자의 오류율 난쟁이 셀 안에 RNA polymerases의 오류율, 때문에 그것은 전통적인 RNA-Seq 데이터 ( 라이브러리 준비로 인 한 유물에서 진정한 전사 오류를 구별 하는 것이 사실상 불가능 그림 1a).
이 문제를 해결 하려면 우리는 최적화 된 버전 원-시퀀싱 (Cirseq, 또는 C-seq 이제)의 분석 결과5,16을 개발 했다. 이 분석 결과 사용자를 transcriptome5전체 RNA에 전사 오류 및 다른 희소 한 이체를 감지 수 있습니다. 원형-시퀀싱 분석 결과이 분석 결과에 중요 한 단계 주위에 회귀 한다 RNA circularization 때문에이 이름을 수행 합니다. 일단 RNA 대상 circularized는, 그들은 역 같은 RNA 서식 파일의 여러 복사본을 포함 하는 선형 cDNA 분자를 생산 하는 롤링 원 패션에 복사할. 이러한 서식 파일 중 하나에 오류가 있었다면,이 오류 cDNA 분자 내에 포함 된 모든 단일 반복에 것도. 대조적으로, 반전 녹음 방송, PCR 확대, 또는 시퀀싱 오류 무작위로 발생 하는 경향이 하 고 따라서 단 하나 또는 두 개의 반복에 있을 것입니다. 따라서, 각 cDNA 분자에 대 한 합의 시퀀스를 생성 하 여 모든 반복에서 발생 하는 오류에서 임의의 오류를 구별 도서관 건축 유물 효과적으로 진정한 전사 오류 (그림 1b)에서 분리 수 있습니다.
C-seq 분석 결과 정확 하 게 어떤 종의 transcriptome 통해 RNA의 기본 대체, 삽입 및 삭제의 속도 감지를 사용할 수 있는 적절 하 게 사용 하는 경우 (예를 들어 트래버스 및 Ochman17참조). 예, 우리는 C-seq 분석 결과를 사용 단일 기본 해상도5 Saccharomyces cerevisiae, 초파리 melanogaster, 그리고 꼬마 선 충 에서 전사의 오류율의 게놈 넓은 측정을 제공 (관찰 되지 않은). 원래 정확 하 게 RNA 바이러스 인구의 시퀀싱 하는 데 사용, C-seq 분석 결과의 최적화 된 버전이 도서관 건축 유물을 라이브러리 준비 하는 동안 가혹한 조건을 최소화 하기 위해 간소화 되었습니다. 또한, 다양 한 상용 키트를 사용 하 여 분석 결과의 처리량은 크게 개선, 자사의 사용자 뿐만 아니라. 적절 하 게 사용 하는 경우이 분석 결과 정확 하 게 수천 복제, 이전 연구6에 그로 인하여 크게 개선 전송 오류를 검색할 수 있습니다. 전반적으로,이 방법은 transcriptional mutagenesis 연구 하는 강력한 도구 이며 사용자 생물의 넓은 범위에서 녹음의 품질을 제어 하는 메커니즘에 새로운 통찰력을 얻을 수 있습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
여기, 우리는 꼬마 선 충, 초파리 melanogaster에 Saccharomyces cerevisiae전송 오류 검출을 위한 C-seq 라이브러리의 준비를 위한 최적화 된 프로토콜을 설명합니다. 이 프로토콜에는 대체 기술 뿐만 아니라 기존 프로토콜을 통해 수많은 장점이 있습니다.
지난 15 년 동안 수많은 기자 시스템 개발 되었습니다 luciferase7,8 또?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 간행물에 의해 되었습니다 (C. Fritsch) 그랜트 T32ES019851에서에서 자금, R01AG054641, 그리고 멀리 젊은 조사자 부여 (M. Vermulst).
Materials
| RiboPure RNA purification kit | ThermoFisher | AM1926 | Total RNA purification |
| Genelute mRNA purification kit | Sigma-Aldrich | MRN70-1KT | mRNA purification |
| Nuclease-free Water | Ambion | AM9937 | Elution and dilution |
| Ambion RNase III | ThermoFisher | AM2290 | RNA fragmentation |
| T4 RNA Ligase 1 (ssRNA Ligase) | New England Biolabs | M0204S | RNA circularization |
| Ribolock | ThermoFisher | EO0381 | RNase inhibitor |
| SuperScript III Reverse Transcriptase | ThermoFisher | 18080044 | Rolling circle reverse transcription |
| 10 mM dNTP mix | ThermoFisher | 18427013 | Rolling circle reverse transcription |
| Random hexamers (50 ng/µl) | ThermoFisher | N8080127 | Rolling circle reverse transcription |
| NEB Second Strand Synthesis Module | New England Biolabs | E6111S | Second Strand Synthesis |
| NEBNext Ultra DNA Library Prep Kit for Illumina | New England Biolabs | E7370S | cDNA library preparation |
| NEB Next index primers | NEB | E7335S | Multiplex PCR primers |
| Oligo Clean & Concentrator | Zymo Research | D4061 | Clean up of RNA and DNA samples |
| DynaMag-2 Magnet | ThermoFisher | 12321D | Magnetic bead purification |
| AMPure XP beads | Beckman Coulter | A63881 | Magnetic bead purification |
| Eppendorf 5424 Microcentrifuge | FisherScientific | 05-403-93 | centrifugation |
| INCU-Shaker 10L | Benchmark Scientific | H1010 | Cell culture |
| T100 Thermal Cycler | BIO RAD | 1861096 | Medium to High temperature cycling conditions |
| PTC-200 Thermal Cycler | GMI | 8252-30-0001 | Low temperature cycling conditions |
| RNase Away | Molecular Bioproducts | 700S-11 | Sterilization |
| 50 ml Centrifuge Tube | Corning | 430290 | Nuclease-free |
| 15 ml Centrifuge Tube | Corning | 430052 | Nuclease-free |
| Eppendorf tubes | USA Scientific | 1615-5500 | Nuclease-free |
| 4200 Tapestation System | Agilent | G2991AA | Nucleotide analysis instrument for quality control of RNA and single stranded DNA samples |
| High Sensitivity RNA Screen Tape | Agilent | 5067-5579 | Quality control of RNA and single stranded DNA samples |
| RNA ScreenTape Sample Buffer | Agilent | 5067-5577 | Quality control of RNA and single stranded DNA samples |
| RNA ScreenTape Ladder | Agilent | 5067-5578 | Quality control of RNA and single stranded DNA samples |
| 2100 Bioanalyzer Instrument | Agilent | G2939BA | Double stranded DNA quality control |
| High Sensitivity DNA Kit | Agilent | 5067-4626 | Quality control for double stranded cDNA samples |
| Water Bath | VWR | 462-0244 | Incubation |
| NanoDrop 2000/2000C Spectrophotometer | ThermoFisher | ND-2000C | Determination of RNA concentration |
Referências
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