Retinal Cryo-sektioner, hele-Mounts og Hypotonic isoleret Vaskulaturen forberedelserne til immunhistokemiske visualisering af mikrovaskulære Pericytes
Summary
Vi viser tre forskellige væv forberedelse teknikker til immunhistokemiske visualisering af rotte retinal mikrovaskulære pericytes, dvs., cryo-sektioner, hele-mounts og hypotonic isolation af det vaskulære netværk.
Abstract
Retinal pericytes spille en vigtig rolle i mange sygdomme i øjet. Immunhistokemisk farvning teknikker af retinale fartøjer og mikrovaskulære er pericytes centrale for oftalmologisk forskning. Det er vigtigt at vælge en passende metode til at visualisere den mikrovaskulære pericytes. Vi beskriver retinal mikrovaskulære pericyte immunhistokemisk farvning i cryo-sektioner, hele-mounts og hypotonic isoleret Vaskulaturen ved hjælp af antistoffer for Trombocyt-afledt vækst faktor receptor β (PDGFRβ) og nerve/glial antigen 2 (NG2). Dette gør det muligt for os at fremhæve fordele og ulemper ved hver af de tre væv forberedelser for visualisering af den retinale mikrovaskulære pericytes. Cryo-sektioner giver transsectional visualisering af alle retinal lag men indeholder kun et par lejlighedsvis tværgående nedskæringer af microvasculature. Hele-mount giver et overblik over hele retinal Vaskulaturen, men visualisering af microvasculature kan være generende. Hypotonic isolation er en metode til at visualisere hele retinal Vaskulaturen ved fjernelse af neuronale celler, men dette gør vævet meget skrøbelige.
Introduction
Retinal pericytes er i fokus i mange forskningslaboratorier, som disse celler spiller en stor rolle i integriteten af Vaskulaturen. Patologiske tilstande såsom diabetisk retinopati1, iskæmi2og grøn stær3 har vaskulære karakteristika, der vedrører funktionen af pericytes. Pericytes findes i de indre nethinde kapillær plexus. Den centrale retinal arterie, der leverer den indre nethinde filialer i to lag af kapillar plexus. Den indre vaskulære seng ligger mellem ganglion celler og indre nukleare lag. De dybere lag er mere tætte og komplekse og er lokaliseret mellem indre og ydre nukleare lag4,5. Nogle dele af nethinden indeholder derudover også et tredje net betegnes radial parapapillary kapillærer. Disse er lange, lige kapillærerne, der ligger blandt nervefibre og sjældent anastomose med hinanden eller de andre to plexus6. Inden for kapillar væggen, pericytes er indlejret i basalmembranen og line abluminal siden af vascular endothelial celler.
Denne dato er der ingen entydige biologisk markør af disse pericytes, der kan skelne dem fra andre vaskulære celler. Trombocyt-afledt vækst faktor receptor β (PDGFRβ) og nerve/glial antigen 2 (NG2) er almindeligt anvendte markører, som begge findes på pericytes men også andre vaskulære celler. Identifikation af pericytes kompliceres yderligere af eksistensen af pericyte delmængder, der varierer i morfologi og protein udtryk7. I øjeblikket bygger den bedste identifikation på en kombination af protein markører og den karakteristiske placering af pericyte i det vaskulære væg. Vi viser her tre forskellige væv forberedelse teknikker til immunhistokemiske PDGFRβ/NG2 farvning af rotte retinal mikrovaskulære pericytes, dvs., cryo-sektioner, hele-mounts og hypotonic isolation af det vaskulære netværk.
Med cryo-sektioner, er nethinden og sclera skåret gennem synsnerven. Dette giver mulighed for visualisering af alle lagdelt strukturer af neuroner. De forskellige ti lag af nethinden er tilsyneladende som udveksling af nukleare og cytoskeletale/dendritiske strukturer, som kan visualiseres med pletter såsom hæmatoxylin/eosin eller fluorescerende nukleare 4′, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)8. De metaboliske krav varierer mellem lag9 , og det giver en metode til at bestemme tykkelsen eller total mangel af en bestemt lag (f.eks.tab af retinal ganglion celler er et af kendetegnene ved retinal iskæmi10, 11). Vaskulaturen fremgår som tværgående skærer igennem nethinden, hvilket gør det muligt at separat studere de kapillære plexus inden for de respektive retinal lag12,13.
Mere traditionelt udføres undersøgelser af retinale Vaskulaturen netværk i retinal hele-mounts. Med dette væv forberedelse, er nethinden skåret og flad som en blomst-formet struktur. Metoden er en forholdsvis hurtig væv forberedelse teknik, der kan fremhæve den overordnede arkitektur retinale kar og det er derfor ofte anvendes i forbindelse med undersøgelsen af neovascularization i murine nethinden. Vellykket visualisering af microvasculature i hele monterede nethinder er også rapporteret i udviklingslandene neonatal mus og rotter nethinden14,15,16,17,18, 19. disse undersøgelser viser en mere defineret pericytic aktivitet med større kapillær-fri områder i den voksne i forhold til neonatal nethinden14.
En anden måde at visualisere er den retinale microvasculature efter hypotonic isolation. Dette væv forberedelse teknik resulterer i retinale blodkar og kapillærer bliver befriet af neuronale celler. Denne type af to-dimensionelle billeddannelse af den isolerede retinale vaskulære netværk er normalt udføres efter retinal trypsin fordøjelsen20 og bruges til at vurdere de vaskulære abnormaliteter af diabetisk retinopati herunder pericyte tab og kapillær degeneration20,21,22. Metoden hypotonic isolation tilbyder undersøgelser af retinal vaskulær gen og protein lovgivningsmæssige svar, som de har gjort med RT-PCR og western blotting23,24,25. Vi giver her en protokol for free-float immunhistokemisk farvning af hypotonic isoleret retinal Vaskulaturen som et alternativ til trypsin fordøjelsen at undersøge den mikrovaskulære pericytes.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vi præsenterer tre retinal forberedelse teknikker, der kan anvendes i studiet af mikrovaskulære retinale pericytes. Nedenfor, vi leverer en sammenligning mellem hver af metoderne og fremhæve kritiske trin i protokollerne.
Med cryo-skæring, nethinden er skåret i sagittal sektioner og derfor er det muligt at opnå mange prøver fra de samme nethinden. De talord sektioner som følge af denne metode gør det et ideelt valg for antistof specificitet og titrering test som det forhindrer unødve…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forskningen blev finansieret af The Lundbeckfonden, Danmark.
Materials
| Geletin from porcine skin | Sigma-Aldrich | G2625-500G | |
| Albumin from chicken egg white | Sigma-Aldrich | A5253-500G | |
| Deoxyribonuclease (DNAse) I from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | D5025-15KU | Dissolved in 0.15 M NaCl |
| Bovine serum albumin (BSA) | VWR | 0332-100G | |
| Normal donkey serum | Jackson ImmunoResearch | 017-000-121, lot 129348 | |
| Rabbit anti-PDGFRβ | Santa Cruz | sc-432 | 1:100 |
| Mouse anti-NG2 | Abcam | ab50009 | 1:500 |
| Alexa Fluor 594 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG | Jackson ImmunoResearch | 711-585-152 | 1:100 |
| Fluorescein (FITC) AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 715-095-151 | 1:100 |
| Cy2 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 711-225-152 | 1:100 |
| Cy3 AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 715-165-150 | 1:100 |
| 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Sigma-Aldrich | D9542-1MG | Dissolved in DMSO |
| Anti-fading mounting medium | Vector Laboratories | H-1000 | |
| Anti-fading mounting medium with DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | |
| Nunc Lab-Tek II 4-well chamber slide | Thermo Fisher Scientific | 154526 |
Referências
- Eshaq, R. S., Aldalati, A. M. Z., Alexander, J. S., Harris, N. R. Diabetic retinopathy: Breaking the barrier. Pathophysiology. , (2017).
- Cai, W., et al. Pericytes in Brain Injury and Repair After Ischemic Stroke. Translational Stroke Research. , (2016).
- Trost, A., et al. Brain and Retinal Pericytes: Origin, Function and Role. Frontiers in Cellular Neuroscience. 10, 20 (2016).
- Ramos, D., Lagali, N., et al. The Use of Confocal Laser Microscopy to Analyze Mouse Retinal Blood Vessels. Confocal Laser Microscopy – Principles and Applications in Medicine, Biology, and the Food Sciences. , (2013).
- Moran, E. P., et al. Neurovascular cross talk in diabetic retinopathy: Pathophysiological roles and therapeutic implications. American Journal of Physiology. Heart and Circulatory Physiolog. 311, H738-H749 (2016).
- Henkind, P. Microcirculation of the peripapillary retina. Transactions – American Academy of Ophthalmology and Otolaryngology. 73, 890-897 (1969).
- Attwell, D., Mishra, A., Hall, C. N., O’Farrell, F. M., Dalkara, T. What is a pericyte?. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 36, 451-455 (2016).
- Fernandez-Bueno, I., et al. Histologic Characterization of Retina Neuroglia Modifications in Diabetic Zucker Diabetic Fatty Rats. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 58, 4925-4933 (2017).
- Yu, D. -. Y., Yu, P. K., Cringle, S. J., Kang, M. H., Su, E. -. N. Functional and morphological characteristics of the retinal and choroidal vasculature. Progress in Retinal and Eye Research. 40, 53-93 (2014).
- Allen, R. S., et al. Severity of middle cerebral artery occlusion determines retinal deficits in rats. Experimental Neurology. 254, 206-215 (2014).
- Kyhn, M. V., et al. Acute retinal ischemia caused by controlled low ocular perfusion pressure in a porcine model. Electrophysiological and histological characterisation. Experimental Eye Research. 88, 1100-1106 (2009).
- Blixt, F. W., Radziwon-Balicka, A., Edvinsson, L., Warfvinge, K. Distribution of CGRP and its receptor components CLR and RAMP1 in the rat retina. Experimental Eye Research. 161, 124-131 (2017).
- Sarlos, S., Wilkinson-Berka, J. L. The renin-angiotensin system and the developing retinal vasculature. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 46, 1069-1077 (2005).
- Wittig, D., Jaszai, J., Corbeil, D., Funk, R. H. W. Immunohistochemical localization and characterization of putative mesenchymal stem cell markers in the retinal capillary network of rodents. Cells Tissues Organs. 197, 344-359 (2013).
- Tual-Chalot, S., Allinson, K. R., Fruttiger, M., Arthur, H. M. Whole mount immunofluorescent staining of the neonatal mouse retina to investigate angiogenesis in vivo. Journal of Visualized Experiments. , e50546 (2013).
- Park, D. Y., et al. Plastic roles of pericytes in the blood-retinal barrier. Nature Communications. 8, 15296 (2017).
- Hughes, S., Chan-Ling, T. Characterization of smooth muscle cell and pericyte differentiation in the rat retina in vivo. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 45, 2795-2806 (2004).
- Lange, C., et al. Intravitreal injection of the heparin analog 5-amino-2-naphthalenesulfonate reduces retinal neovascularization in mice. Experimental Eye Research. 85, 323-327 (2007).
- Higgins, R. D., et al. Diltiazem reduces retinal neovascularization in a mouse model of oxygen induced retinopathy. Current Eye Research. 18, 20-27 (1999).
- Chou, J. C., Rollins, S. D., Fawzi, A. A. Trypsin digest protocol to analyze the retinal vasculature of a mouse model. Journal of Visualized Experiments. , e50489 (2013).
- Hazra, S., et al. Liver X receptor modulates diabetic retinopathy outcome in a mouse model of streptozotocin-induced diabetes. Diabetes. 61, 3270-3279 (2012).
- Zhang, L., Xia, H., Han, Q., Chen, B. Effects of antioxidant gene therapy on the development of diabetic retinopathy and the metabolic memory phenomenon. Graefe’s Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 253, 249-259 (2015).
- Dagher, Z., et al. Studies of rat and human retinas predict a role for the polyol pathway in human diabetic retinopathy. Diabetes. 53, 2404-2411 (2004).
- Navaratna, D., McGuire, P. G., Menicucci, G., Das, A. Proteolytic degradation of VE-cadherin alters the blood-retinal barrier in diabetes. Diabetes. 56, 2380-2387 (2007).
- Gustavsson, C., et al. Vascular cellular adhesion molecule-1 (VCAM-1) expression in mice retinal vessels is affected by both hyperglycemia and hyperlipidemia. PLoS One. 5, e12699 (2010).
- Kornfield, T. E., Newman, E. A. Regulation of blood flow in the retinal trilaminar vascular network. Journal of Neuroscience. 34, 11504-11513 (2014).
- Puro, D. G. Retinovascular physiology and pathophysiology: new experimental approach/new insights. Progress in Retinal and Eye Research. 31, 258-270 (2012).
