הקפאה-מקטעי רשתית, שלם-טעינות, וההכנות להערכת מבודד היפוטוניק להמחשת Immunohistochemical של Microvascular Pericytes
Summary
נדגים שלוש טכניקות להכנת רקמות שונות להמחשת immunohistochemical של pericytes microvascular ברשתית עכברוש, קרי, הקפאה-סעיפים, שלם-טעינות בידוד היפוטוניק של רשת כלי הדם.
Abstract
Pericytes ברשתית תפקיד חשוב למחלות רבות של העין. Immunohistochemical מכתים טכניקות של כלי רשתית microvascular pericytes הן גורם מרכזי מחקר ophthalmological. זה חיוני כדי לבחור שיטה המתאימה להמחיש את pericytes microvascular. אנו מתארים רשתית pericyte microvascular immunohistochemical מכתים הקפאה-סעיפים, שלם-mounts ו היפוטוניק להערכת מבודדים באמצעות נוגדנים עבור β קולטן גורם גידול נגזר טסית דם (PDGFRβ) ועצב/גליה אנטיגן 2 (NG2). זה מאפשר לנו להדגיש את היתרונות ואת החסרונות של כל אחד שלוש רקמות ההכנות החזיית pericytes microvascular ברשתית. הקפאה-סעיפים לספק transsectional ויזואליזציה של כל השכבות ברשתית אך מכיל רק כמה ומדי פעם רוחבי שמכינים microvasculature. כולה-הר מספק סקירה של להערכת ברשתית כולו, אבל ויזואליזציה של microvasculature יכול להיות בעייתי. בידוד היפוטוניק מספק שיטה כדי להמחיש את להערכת ברשתית כולו על ידי הסרת תאים עצביים, אבל זה הופך את הרקמה שברירי.
Introduction
Pericytes ברשתית הם המוקד של מעבדות מחקר רבים כמו תאים אלה ממלאים תפקיד מרכזי באינטגריטי של להערכת. מצבים פתולוגיים כגון רטינופתיה סוכרתית1, איסכמיה2וגלאוקומה3 יש מאפייני וסקולרית המערבות את הפונקציה של pericytes. Pericytes ניתן למצוא את plexuses הפנימית נימי ברשתית. עורק רשתית מרכזי המספק הרשתית פנימי מסתעף שתי שכבות של plexuses נימי. המיטה כלי הדם הפנימיים ממוקם בין שכבות הגרעין הפנימי תא גנגליון. לרובד העמוק יותר צפוף ומורכב, הוא מקומי בין השכבות הפנימיות והחיצוניות גרעיני4,5. בנוסף, חלקים מסוימים של הרשתית מכילים גם לרשת השלישית כינה הנימים parapapillary רדיאלי. אלו הם ארוכים, נימים ישר שנמצאים בין סיבי העצב ולעיתים רחוקות anastomose עם אחד לשני או אחרים plexuses שני6. בתוך הקיר נימי, pericytes נעוצים קרום המרתף, קו הצד abluminal של תאי אנדותל כלי הדם.
מועד זה, יש אין סמן ביולוגי ייחודי של אלה pericytes יכול להבדיל אותם מתאי דם אחרים. Β קולטן גורם גידול נגזר טסית דם (PDGFRβ) עצב/גליה אנטיגן 2 (NG2) נפוץ סמנים אשר שניהם מציגים על pericytes אבל גם אחרים בתאי הדם בקרב אנשי עסקים ותיירים כאחד. זיהוי של pericytes מסובך עוד יותר בקיומן של קבוצות משנה pericyte נבדלים ביטוי חלבון ומורפולוגיה7. כיום, הזיהוי הטוב ביותר מתבססת על שילוב של סמני חלבונים, את מיקום אופייני pericyte בדופן כלי הדם. נדגים כאן שלוש טכניקות להכנת רקמות שונות עבור נוגדן PDGFRβ/NG2 pericytes microvascular ברשתית עכברוש, קרי, הקפאה-סעיפים, שלם-טעינות, ו בידוד היפוטוניק של רשת כלי הדם.
עם הקפאה-חלקים, הרשתית ואת בסקלרה נחתכים דרך עצב הראייה. דבר זה מאפשר הפריט החזותי של כל מבני שכבות של נוירונים. הרבדים עשר ברורים של הרשתית נראים לעין כמו מתחלפות מבנים גרעינית, עצב/דנדריטים, ניתן לאבחן עם כתמים כגון hematoxylin/אאוזין או פלורסנט גרעיני 4′, 6-diamidino-2-phenylindole (דאפי)8. הדרישות מטבוליים שונים בין שכבות9 וזה מספק שיטה לקביעת העדר עובי או סך של שכבה מסוימת (למשל, אובדן תאי גנגליון נמנה עם גולת הכותרת של איסכמיה ברשתית10, 11). להערכת מתבטא כפי רוחבי חתכים דרך הרשתית, כך שניתן ללמוד בנפרד את plexuses נימי בתוך שכבות הרשתית בהתאמה12,13.
באופן מסורתי יותר, החקירות של הרשת להערכת ברשתית מבוצעות בכל רשתית-טעינות. עם הכנת הרקמה, הרשתית לחתוך, משוטחים כמבנה בצורת פרח. השיטה היא טכניקה הכנה רקמות מהיר יחסית ניתן לסמן להערכת ברשתית הכוללת את אדריכלות והיא ולכן לעיתים קרובות חלה לגבי חקירת כורוידאלית ברשתית מאתר. ויזואליזציה מוצלח של microvasculature ב רשתית רכוב כל הוא דיווח גם העכבר neonatal המתפתח, עכברוש רשתית14,15,16,17,18, 19. מחקרים אלה לחשוף את פעילות pericytic מוגדרים יותר עם אזורים גדולים יותר ללא נימי במבוגר בהשוואה רשתית neonatal14.
דרך נוספת של ויזואליזציה של היא microvasculature ברשתית לאחר בידוד היפוטוניק. טכניקה זו הכנה רקמות התוצאה כלי הדם ברשתית נימים להיות משוחררים של תאים עצביים. סוג זה של הדמיה דו מימדי של רשת כלי הדם ברשתית מבודד הוא בדרך כלל לאחר עיכול טריפסין ברשתית20 ואין להשתמש כדי להעריך את חריגות בכלי הדם של רטינופתיה סוכרתית כולל אובדן pericyte נימי ניוון20,21,22. שיטת בידוד היפוטוניק מציעה החקירות של ג’ין כלי הדם ברשתית ותגובות חלבון רגולטורי הם סיים עם RT-PCR והמערבי סופג23,24,25. אנו מספקים כאן פרוטוקול עבור החזקות חינם נוגדן של להערכת ברשתית מבודדים היפוטוניק כחלופה טריפסין לעיכול כדי לבחון את pericytes microvascular.
Protocol
Representative Results
Discussion
אנו מציגים שלוש טכניקות הכנה רשתית שניתן להחיל במחקר של microvascular pericytes ברשתית. להלן, אנו לספק השוואה בין כל אחת מהשיטות, לסמן את השלבים הקריטיים של הפרוטוקולים.
עם חלוקתה הקפאה, הרשתית נחתך בסעיפים הווריד, לכן, זה אפשרי להשיג דגימות רבות של הרשתית אותו. הסעיפים ספרתיות הנובע בש…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחקר מומן על ידי קרן לונדבק, דנמרק.
Materials
| Geletin from porcine skin | Sigma-Aldrich | G2625-500G | |
| Albumin from chicken egg white | Sigma-Aldrich | A5253-500G | |
| Deoxyribonuclease (DNAse) I from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | D5025-15KU | Dissolved in 0.15 M NaCl |
| Bovine serum albumin (BSA) | VWR | 0332-100G | |
| Normal donkey serum | Jackson ImmunoResearch | 017-000-121, lot 129348 | |
| Rabbit anti-PDGFRβ | Santa Cruz | sc-432 | 1:100 |
| Mouse anti-NG2 | Abcam | ab50009 | 1:500 |
| Alexa Fluor 594 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG | Jackson ImmunoResearch | 711-585-152 | 1:100 |
| Fluorescein (FITC) AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 715-095-151 | 1:100 |
| Cy2 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 711-225-152 | 1:100 |
| Cy3 AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 715-165-150 | 1:100 |
| 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Sigma-Aldrich | D9542-1MG | Dissolved in DMSO |
| Anti-fading mounting medium | Vector Laboratories | H-1000 | |
| Anti-fading mounting medium with DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | |
| Nunc Lab-Tek II 4-well chamber slide | Thermo Fisher Scientific | 154526 |
Referências
- Eshaq, R. S., Aldalati, A. M. Z., Alexander, J. S., Harris, N. R. Diabetic retinopathy: Breaking the barrier. Pathophysiology. , (2017).
- Cai, W., et al. Pericytes in Brain Injury and Repair After Ischemic Stroke. Translational Stroke Research. , (2016).
- Trost, A., et al. Brain and Retinal Pericytes: Origin, Function and Role. Frontiers in Cellular Neuroscience. 10, 20 (2016).
- Ramos, D., Lagali, N., et al. The Use of Confocal Laser Microscopy to Analyze Mouse Retinal Blood Vessels. Confocal Laser Microscopy – Principles and Applications in Medicine, Biology, and the Food Sciences. , (2013).
- Moran, E. P., et al. Neurovascular cross talk in diabetic retinopathy: Pathophysiological roles and therapeutic implications. American Journal of Physiology. Heart and Circulatory Physiolog. 311, H738-H749 (2016).
- Henkind, P. Microcirculation of the peripapillary retina. Transactions – American Academy of Ophthalmology and Otolaryngology. 73, 890-897 (1969).
- Attwell, D., Mishra, A., Hall, C. N., O’Farrell, F. M., Dalkara, T. What is a pericyte?. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 36, 451-455 (2016).
- Fernandez-Bueno, I., et al. Histologic Characterization of Retina Neuroglia Modifications in Diabetic Zucker Diabetic Fatty Rats. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 58, 4925-4933 (2017).
- Yu, D. -. Y., Yu, P. K., Cringle, S. J., Kang, M. H., Su, E. -. N. Functional and morphological characteristics of the retinal and choroidal vasculature. Progress in Retinal and Eye Research. 40, 53-93 (2014).
- Allen, R. S., et al. Severity of middle cerebral artery occlusion determines retinal deficits in rats. Experimental Neurology. 254, 206-215 (2014).
- Kyhn, M. V., et al. Acute retinal ischemia caused by controlled low ocular perfusion pressure in a porcine model. Electrophysiological and histological characterisation. Experimental Eye Research. 88, 1100-1106 (2009).
- Blixt, F. W., Radziwon-Balicka, A., Edvinsson, L., Warfvinge, K. Distribution of CGRP and its receptor components CLR and RAMP1 in the rat retina. Experimental Eye Research. 161, 124-131 (2017).
- Sarlos, S., Wilkinson-Berka, J. L. The renin-angiotensin system and the developing retinal vasculature. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 46, 1069-1077 (2005).
- Wittig, D., Jaszai, J., Corbeil, D., Funk, R. H. W. Immunohistochemical localization and characterization of putative mesenchymal stem cell markers in the retinal capillary network of rodents. Cells Tissues Organs. 197, 344-359 (2013).
- Tual-Chalot, S., Allinson, K. R., Fruttiger, M., Arthur, H. M. Whole mount immunofluorescent staining of the neonatal mouse retina to investigate angiogenesis in vivo. Journal of Visualized Experiments. , e50546 (2013).
- Park, D. Y., et al. Plastic roles of pericytes in the blood-retinal barrier. Nature Communications. 8, 15296 (2017).
- Hughes, S., Chan-Ling, T. Characterization of smooth muscle cell and pericyte differentiation in the rat retina in vivo. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 45, 2795-2806 (2004).
- Lange, C., et al. Intravitreal injection of the heparin analog 5-amino-2-naphthalenesulfonate reduces retinal neovascularization in mice. Experimental Eye Research. 85, 323-327 (2007).
- Higgins, R. D., et al. Diltiazem reduces retinal neovascularization in a mouse model of oxygen induced retinopathy. Current Eye Research. 18, 20-27 (1999).
- Chou, J. C., Rollins, S. D., Fawzi, A. A. Trypsin digest protocol to analyze the retinal vasculature of a mouse model. Journal of Visualized Experiments. , e50489 (2013).
- Hazra, S., et al. Liver X receptor modulates diabetic retinopathy outcome in a mouse model of streptozotocin-induced diabetes. Diabetes. 61, 3270-3279 (2012).
- Zhang, L., Xia, H., Han, Q., Chen, B. Effects of antioxidant gene therapy on the development of diabetic retinopathy and the metabolic memory phenomenon. Graefe’s Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 253, 249-259 (2015).
- Dagher, Z., et al. Studies of rat and human retinas predict a role for the polyol pathway in human diabetic retinopathy. Diabetes. 53, 2404-2411 (2004).
- Navaratna, D., McGuire, P. G., Menicucci, G., Das, A. Proteolytic degradation of VE-cadherin alters the blood-retinal barrier in diabetes. Diabetes. 56, 2380-2387 (2007).
- Gustavsson, C., et al. Vascular cellular adhesion molecule-1 (VCAM-1) expression in mice retinal vessels is affected by both hyperglycemia and hyperlipidemia. PLoS One. 5, e12699 (2010).
- Kornfield, T. E., Newman, E. A. Regulation of blood flow in the retinal trilaminar vascular network. Journal of Neuroscience. 34, 11504-11513 (2014).
- Puro, D. G. Retinovascular physiology and pathophysiology: new experimental approach/new insights. Progress in Retinal and Eye Research. 31, 258-270 (2012).
