रेटिना क्रायो-वर्गों, पूरे mounts, और Hypotonic Microvascular Pericytes के Immunohistochemical दृश्य के लिए अलग Vasculature तैयारी
Summary
हम चूहे रेटिना microvascular pericytes के immunohistochemical दृश्य के लिए तीन अलग ऊतक तैयार करने की तकनीक का प्रदर्शन, यानी, क्रायो-वर्गों, पूरे माउंट, और संवहनी नेटवर्क के hypotonic अलगाव.
Abstract
रेटिना pericytes आंख के कई रोगों में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं । रेटिना वाहिकाओं और microvascular pericytes के Immunohistochemical धुंधला तकनीक नेत्र विज्ञान अनुसंधान के लिए केंद्रीय हैं । यह microvascular pericytes visualizing की एक उपयुक्त विधि का चयन करने के लिए महत्वपूर्ण है । हम रेटिना microvascular pericyte immunohistochemical क्रायो में दाग-वर्गों, पूरे-माउंट, और hypotonic अलग vasculature प्लेटलेट के लिए एंटीबॉडी का उपयोग कर वृद्धि कारक रिसेप्टर β (PDGFRβ) और तंत्रिका/glial प्रतिजन 2 (NG2) का वर्णन. यह हमें लाभ और रेटिना microvascular pericytes के दृश्य के लिए तीन ऊतक तैयार करने में से प्रत्येक की कमियों को उजागर करने की अनुमति देता है । क्रायो-वर्गों सभी रेटिना परतों के transsectional दृश्य प्रदान करते हैं, लेकिन केवल microvasculature के कुछ सामयिक अनुप्रस्थ कटौती होते हैं. पूरे-माउंट पूरे रेटिना vasculature का एक सिंहावलोकन प्रदान करता है, लेकिन microvasculature के दृश्य परेशानी हो सकती है । Hypotonic अलगाव ंयूरॉन कोशिकाओं को हटाने के द्वारा पूरे रेटिना vasculature कल्पना करने के लिए एक विधि प्रदान करता है, लेकिन यह बहुत नाजुक ऊतक बनाता है ।
Introduction
रेटिना pericytes कई अनुसंधान प्रयोगशालाओं का ध्यान केंद्रित कर रहे हैं के रूप में इन कोशिकाओं vasculature की अखंडता में एक प्रमुख भूमिका निभाते हैं. ऐसे मधुमेह रेटिनोपैथी1, ischemia2के रूप में रोग की स्थिति, और मोतियाबिंद3 संवहनी विशेषताओं है कि pericytes के समारोह में शामिल है । Pericytes भीतरी रेटिना केशिका जाल में पाए जाते हैं । केंद्रीय रेटिना धमनी कि केशिका जाल के दो परतों में भीतरी रेटिना शाखाओं की आपूर्ति. भीतरी संवहनी बिस्तर नाड़ीग्रंथि सेल और भीतरी परमाणु परतों के बीच स्थित है । गहरी परत और अधिक घने और जटिल है और भीतरी और बाहरी परमाणु परतों के बीच स्थानीयकृत है4,5। इसके अलावा, रेटिना के कुछ भागों में भी एक तिहाई नेटवर्क रेडियल parapapillary केशिकाओं का कार्यकाल शामिल है । ये लंबे, सीधे केशिकाओं कि तंत्रिका तंतुओं के बीच झूठ और शायद ही कभी एक दूसरे या अंय दो जाल6के साथ anastomose हैं । केशिका दीवार के भीतर, pericytes तहखाने झिल्ली में एंबेडेड और संवहनी endothelial कोशिकाओं के abluminal पक्ष लाइन कर रहे हैं ।
इस तिथि के लिए, इन pericytes के कोई अद्वितीय जैविक मार्कर है कि उंहें अंय संवहनी कोशिकाओं से अंतर कर सकते हैं । प्लेटलेट-व्युत्पन्न वृद्धि कारक रिसेप्टर β (PDGFRβ) और तंत्रिका/glial प्रतिजन 2 (NG2) आमतौर पर दोनों pericytes पर भी मौजूद है जो मार्करों इस्तेमाल कर रहे हैं, लेकिन अन्य संवहनी कोशिकाओं. pericytes की पहचान और pericyte उपसमुच्चय है कि आकृति विज्ञान और प्रोटीन अभिव्यक्ति7में भिंनता के अस्तित्व से आगे जटिल है । वर्तमान में, सबसे अच्छी पहचान प्रोटीन मार्करों और संवहनी दीवार में pericyte की विशेषता स्थिति का एक संयोजन पर निर्भर करता है । हम यहां immunohistochemical PDGFRβ के लिए तीन अलग ऊतक तैयार करने की तकनीक का प्रदर्शन/NG2 चूहा रेटिना microvascular pericytes, यानी, क्रायो-वर्गों, पूरे mounts के धुंधला, और संवहनी नेटवर्क के hypotonic अलगाव ।
क्रायो-वर्गों के साथ, रेटिना और श्वेतपटल ऑप्टिक तंत्रिका के माध्यम से काट रहे हैं । यह ंयूरॉंस के सभी स्तरित संरचनाओं के दृश्य के लिए अनुमति देता है । रेटिना की अलग दस परतों परमाणु और axonal/वृक्ष संरचनाओं कि hematoxylin/eosin या फ्लोरोसेंट परमाणु 4 ‘, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)8के रूप में दाग के साथ कल्पना की जा सकती है कि बदलते के रूप में स्पष्ट कर रहे हैं । चयापचय आवश्यकताओं परतों9 के बीच अलग है और यह एक विशिष्ट परत की मोटाई या कुल अनुपस्थिति का निर्धारण करने के लिए एक विधि प्रदान करता है (उदाहरणके लिए, रेटिना नाड़ीग्रंथि कोशिकाओं का नुकसान रेटिना10ischemia की पहचान में से एक है, 11). vasculature रेटिना के माध्यम से अनुप्रस्थ कटौती के रूप में स्पष्ट है, यह अलग से संबंधित रेटिना परतों के भीतर केशिका जाल का अध्ययन करने के लिए संभव बनाने12,13.
अधिक परंपरागत रूप से, रेटिना vasculature नेटवर्क की जांच रेटिना पूरे माउंट में प्रदर्शन कर रहे हैं. इस ऊतक तैयारी के साथ, रेटिना कट और एक फूल के आकार का संरचना के रूप में समतल है । विधि एक अपेक्षाकृत तेजी से ऊतक तैयारी तकनीक है कि समग्र वास्तुकला रेटिना vasculature को उजागर कर सकते है और यह इसलिए अक्सर murine रेटिना में neovascularization की जांच में लागू किया जाता है । पूरे घुड़सवार रेटिना में microvasculature के सफल दृश्य भी विकासशील नवजात चूहे और चूहे रेटिना में सूचना दी है14,15,16,17,18, 19. ये अध्ययन नवजात रेटिना14की तुलना में वयस्क में बड़े केशिका-मुक्त क्षेत्रों के साथ एक अधिक परिभाषित pericytic गतिविधि प्रकट करते हैं ।
visualizing का एक और तरीका है hypotonic अलगाव के बाद रेटिना microvasculature है । यह ऊतक तैयारी तकनीक परिणाम में रेटिना रक्त वाहिकाओं और केशिकाओं न्यूरॉन्स कोशिकाओं से मुक्त किया जा रहा. अलग रेटिना संवहनी नेटवर्क के दो आयामी इमेजिंग के इस प्रकार आमतौर पर रेटिना trypsin पाचन20 के बाद किया जाता है और pericyte हानि और केशिका सहित मधुमेह रेटिनोपैथी के संवहनी विषमताओं का आकलन करने के लिए इस्तेमाल किया अध२०,२१,२२. hypotonic आइसोलेशन विधि रेटिना संवहनी जीन और प्रोटीन विनियामक प्रतिक्रियाओं की जांच प्रदान करता है के रूप में वे आरटी के साथ किया गया है-पीसीआर और पश्चिमी सोख्ता23,24,25। हम यहां के लिए एक प्रोटोकॉल प्रदान मुक्त फ्लोट immunohistochemical धुंधला hypotonic पृथक रेटिना vasculature के लिए एक विकल्प के रूप में trypsin पाचन microvascular pericytes की जांच करने के लिए ।
Protocol
Representative Results
Discussion
हम तीन रेटिना तैयार करने की तकनीक है कि microvascular रेटिना pericytes के अध्ययन में लागू किया जा सकता पेश करते हैं । नीचे, हम प्रत्येक विधि के बीच तुलना प्रदान करते हैं और प्रोटोकॉल में महत्वपूर्ण चरणों को हाइलाइट कर?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
अनुसंधान Lundbeck फाउंडेशन, डेनमार्क द्वारा वित्त पोषित किया गया ।
Materials
| Geletin from porcine skin | Sigma-Aldrich | G2625-500G | |
| Albumin from chicken egg white | Sigma-Aldrich | A5253-500G | |
| Deoxyribonuclease (DNAse) I from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | D5025-15KU | Dissolved in 0.15 M NaCl |
| Bovine serum albumin (BSA) | VWR | 0332-100G | |
| Normal donkey serum | Jackson ImmunoResearch | 017-000-121, lot 129348 | |
| Rabbit anti-PDGFRβ | Santa Cruz | sc-432 | 1:100 |
| Mouse anti-NG2 | Abcam | ab50009 | 1:500 |
| Alexa Fluor 594 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG | Jackson ImmunoResearch | 711-585-152 | 1:100 |
| Fluorescein (FITC) AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 715-095-151 | 1:100 |
| Cy2 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 711-225-152 | 1:100 |
| Cy3 AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 715-165-150 | 1:100 |
| 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Sigma-Aldrich | D9542-1MG | Dissolved in DMSO |
| Anti-fading mounting medium | Vector Laboratories | H-1000 | |
| Anti-fading mounting medium with DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | |
| Nunc Lab-Tek II 4-well chamber slide | Thermo Fisher Scientific | 154526 |
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