Cryo-sezioni della retina, intero-monta e ipotonico Vasculature isolato preparazioni per la visualizzazione di Immunohistochemical dei Pericytes microvascolare
Summary
Dimostriamo di tre tecniche di preparazione dei tessuti differenti per la visualizzazione di immunohistochemical di periciti microvascolare del ratto, vale a dire, cryo-sezioni, intero-monta e ipotonico isolamento della rete vascolare.
Abstract
Periciti giocano un ruolo importante in molte malattie dell’occhio. Tecniche dei vasi retinici e microvascolare di macchiatura immunohistochemical periciti sono al centrali di ricerca oftalmologica. È fondamentale scegliere un metodo appropriato di visualizzare i pericytes microvascolari. Descriviamo retinica Pericita microvascolare immunoistochimica in cryo-sezioni, intero-monta e sistema vascolare isolato ipotonico usando gli anticorpi per β del ricevitore di fattore di crescita derivato dalle piastrine (PDGFRβ) e l’antigene del nervo/glial 2 (NG2). Questo permette di evidenziare vantaggi e difetti di ciascuna delle preparazioni del tre tessuto per la visualizzazione dei periciti microvascolare. Cryo-sezioni forniscono transsectional visualizzazione di tutti gli strati retinici ma contengono solo qualche occasionale taglio trasversale del microvasculature. Intero-monta fornisce una panoramica dell’intero sistema vascolare retinico, ma la visualizzazione del microvasculature può essere fastidioso. Ipotonica isolamento fornisce un metodo per visualizzare l’intero sistema vascolare retinico tramite la rimozione delle cellule neuronali, ma questo rende il tessuto molto fragile.
Introduction
Periciti sono al centro di molti laboratori di ricerca come queste cellule svolgono un ruolo importante nell’integrità del sistema vascolare. Condizioni patologiche quali retinopatia diabetica1, ischemia2e glaucoma3 hanno caratteristiche vascolari che coinvolgono la funzione di periciti. I periciti sono trovati in plessi capillari retinici interni. Arteria retinica centrale che fornisce i rami retina interna in due strati dei plexuses capillari. Il letto vascolare interno è situato tra la cellula del ganglio e strati interni di nucleare. Lo strato più profondo è più denso e complesso ed è localizzato tra lo strato nucleare interno ed esterno4,5. Inoltre, alcune parti della retina contengono anche una terza rete definita i capillari parapapillary radiale. Questi sono lunghi, dritti capillari che si trovano tra le fibre nervose e raramente anastomotizzare con un l’altro o gli altri due plessi6. All’interno della parete capillare, i periciti sono incorporati nella membrana dello scantinato e linea lato abluminale delle cellule endoteliali vascolari.
A questa data, esiste un marker biologico unico di questi periciti che possibile distinguerle da altre cellule vascolari. Β del ricevitore di fattore di crescita derivato dalle piastrine (PDGFRβ) e l’antigene del nervo/glial 2 (NG2) sono comunemente utilizzati marcatori che entrambi presentano il pericytes ma anche altre cellule vascolari. Identificazione dei pericytes è ulteriormente complicata dall’esistenza di sottoinsiemi di periciti che variano nell’ espressione della proteina e morfologia7. Attualmente, la migliore identificazione si basa su una combinazione di proteine marker e il posizionamento caratteristico del Pericita nella parete vascolare. Dimostriamo qui tre tecniche di preparazione dei tessuti differenti per la macchiatura di immunohistochemical PDGFRβ/NG2 di periciti microvascolare del ratto, vale a dire, cryo-sezioni, intero-monta e ipotonico isolamento della rete vascolare.
Con cryo-sezioni, la retina e la sclera sono tagliate attraverso il nervo ottico. Ciò consente la visualizzazione di tutte le strutture a strati di neuroni. I dieci strati distinti della retina sono evidenti come lo scambio di strutture nucleari e assonale/dendritiche che possono essere visualizzate con macchie quali ematossilina/eosina o fluorescente nucleare 4′, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)8. I requisiti metabolici differiscono tra i livelli9 e si fornisce un metodo per determinare lo spessore o la totale assenza di un livello specifico (ad esempio, la perdita delle cellule ganglionari retiniche è uno dei tratti distintivi di ischemia retinica10, 11). Il sistema vascolare è evidente come attraverso la retina, rendendo possibile studiare separatamente i plexuses capillari all’interno i rispettivi strati retinici12,13tagli trasversali.
Più tradizionalmente, le indagini della rete sistema vascolare retinico sono effettuate in intero-monta retinica. Con questa preparazione del tessuto, la retina è tagliata e appiattita come una struttura a forma di fiore. Il metodo è una tecnica di preparazione del tessuto relativamente veloce che permette di evidenziare il vasculature retinico di architettura globale e pertanto è spesso applicato nell’inchiesta della neovascolarizzazione della retina murino. Visualizzazione successo del microvasculature in retine montato tutto è segnalato anche nel sviluppo neonatale topo e nel ratto retina14,15,16,17,18, 19. questi studi rivelano una più definita attività pericitica con grandi aree senza capillare nell’adulto rispetto al retina neonatale14.
Un altro modo di visualizzare è il microcircolo retinico dopo isolamento ipotonica. Questa tecnica di preparazione del tessuto si traduce in vasi sanguigni retinici e capillari viene liberati delle cellule neuronali. Questo tipo di rappresentazione bidimensionale della rete vascolare retinica isolata è solitamente eseguito dopo retinica tripsina digestione20 e utilizzato per valutare le anomalie vascolari della retinopatia diabetica, compreso perdita di periciti e capillare degenerazione20,21,22. Il metodo di isolamento ipotonico offre le indagini del gene vascolare retinica e risposte normative proteina come è stato fatto con RT-PCR e western blotting23,24,25. Forniamo qui un protocollo per la macchiatura di immunohistochemical di flottante del vasculature retinico isolato ipotonico come alternativa alla digestione della tripsina per esaminare i pericytes microvascolari.
Protocol
Representative Results
Discussion
Presentiamo tre tecniche di preparazione della retina che possono essere applicate nello studio dei periciti microvascolari. Qui di seguito, forniamo un confronto tra ciascuno dei metodi ed evidenziare passi critici nei protocolli.
Con cryo-sezionamento, la retina è tagliata in sezioni sagittali e quindi, è possibile ottenere numerosi esemplari dalla retina stessa. Le sezioni numerale derivanti da questo metodo lo rendono la scelta ideale per la specificità dell’anticorpo e titolazione test…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
La ricerca è stata finanziata dalla Fondazione Lundbeck, Danimarca.
Materials
| Geletin from porcine skin | Sigma-Aldrich | G2625-500G | |
| Albumin from chicken egg white | Sigma-Aldrich | A5253-500G | |
| Deoxyribonuclease (DNAse) I from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | D5025-15KU | Dissolved in 0.15 M NaCl |
| Bovine serum albumin (BSA) | VWR | 0332-100G | |
| Normal donkey serum | Jackson ImmunoResearch | 017-000-121, lot 129348 | |
| Rabbit anti-PDGFRβ | Santa Cruz | sc-432 | 1:100 |
| Mouse anti-NG2 | Abcam | ab50009 | 1:500 |
| Alexa Fluor 594 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG | Jackson ImmunoResearch | 711-585-152 | 1:100 |
| Fluorescein (FITC) AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 715-095-151 | 1:100 |
| Cy2 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 711-225-152 | 1:100 |
| Cy3 AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 715-165-150 | 1:100 |
| 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Sigma-Aldrich | D9542-1MG | Dissolved in DMSO |
| Anti-fading mounting medium | Vector Laboratories | H-1000 | |
| Anti-fading mounting medium with DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | |
| Nunc Lab-Tek II 4-well chamber slide | Thermo Fisher Scientific | 154526 |
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