網膜の低温電子顕微鏡セクション全体-マウント、および微小血管の免疫組織化学的可視化の低張性分離血管準備
Summary
ラット網膜血管ペリサイト、すなわち、低温セクション、全体-マウント、および血管ネットワークの低張性分離の免疫組織化学的可視化のための 3 つの異なったティッシュ準備テクニックを紹介します。
Abstract
網膜血管は目の多くの疾患で重要な役割を果たします。免疫組織化学的染色技術網膜血管と血管ペリサイト眼科研究の中心であります。微小血管を可視化する適切な方法を選ぶことが大切です。網膜血管周皮細胞免疫組織化学的染色クライオ セクション、全体-マウント、および血小板由来増殖因子受容体 β (PDGFRβ) と 2 (NG2) 神経・ グリア抗原抗体を用いた分離の低張性の血管について述べる。これは利点と網膜の微小血管の可視化の 3 つのティッシュの準備のそれぞれの欠点を強調する私たちことができます。低温セクションすべての網膜の層の transsectional 可視化がだけいくつか時折横のカット、血管を含みます。全体マウント全体の網膜血管の概要を説明しますが、血管の可視化は面倒なことができます。低張性の分離は、神経細胞の除去による全体の網膜血管を可視化するメソッドを提供しますが、これは非常に壊れやすい組織になります。
Introduction
網膜の血管は、これらの細胞は、血管系の整合性に大きな役割を果たす多くの研究所の焦点です。糖尿病網膜症1、虚血2緑内障3など病態ペリサイトの関数を含む血管の特徴であります。ペリサイトは内側の網膜毛細血管叢で発見されます。毛細血管叢の 2 つの層に内部の網膜を供給する網膜中心動脈の枝.内側の血管床が神経節細胞と内部の核層の間に位置しています。深い層はより濃厚で複雑と内側と外側核層4,5間ローカライズされます。さらに、網膜の一部には、放射状の脈絡毛細血管と呼ばれる 3 番目のネットワークも含まれています。これらの長い、そして稀に神経線維間でうそをつくストレート毛細血管が別の 1 つまたは他の 2 つの叢6と吻合します。毛細血管の壁内ペリサイトは基底膜に埋め込まれているし、血管内皮細胞の abluminal 側のラインします。
これまで、他の血管の細胞と区別することができますこれらのペリサイトのユニークな生物学的マーカーはありません。血小板由来増殖因子受容体 β (PDGFRβ) 神経・ グリア抗原 2 (NG2) は、また他の血管細胞ですが血管に存在する一般的に使用されるマーカー。ペリサイトの同定は、形態および蛋白質の表現7で異なる周皮細胞サブセットの存在によってさらに複雑です。現在、最高の識別は、蛋白質のマーカーの組み合わせと血管壁の周皮細胞の特徴的な位置に依存します。免疫 PDGFRβ/NG2 ラット網膜血管ペリサイト、すなわち、低温セクション、全体-マウント、および血管ネットワークの低張性分離の汚損のための 3 つの異なる組織準備テクニックをここで紹介します。
低温セクション、網膜と強膜は視神経を通ってカットされます。ニューロンのすべて層状構造の可視化が可能になります。網膜の異なる 10 層ヘマトキシリン ・ エオシンや蛍光核 4′, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)8などの汚れを視覚化できる核や軸索・樹状突起の構造を交換として明らかにされます。層9と代謝の要件とは異なる特定の層の厚さまたは合計の不在を決定するメソッドを提供します (例えば、網膜神経節細胞の損失は網膜虚血10、認刻極印の 1 つ 11)。横を通り過ぎるそれぞれ網膜層12,13内毛細血管叢を個別に研究することが可能となって、網膜血管は明らか。
従来より、網膜血管ネットワークの調査は、網膜全体のマウントで実行されます。このティッシュの準備と網膜はカットして花状の構造として平ら。メソッドは、全体的なアーキテクチャの網膜血管を強調表示することができます比較的高速な組織の準備法としたがってしばしばマウス網膜血管新生の調査で適用。全体に取り付けられた網膜の血管の正常な可視化は発展途上の新生児マウスとラット網膜14,15,16,17,18,で報告も19. これらの研究は新生児網膜14に比べて大人に大きいキャピラリー自由な区域でより多くの定義 pericytic 活動を明らかにします。
可視化する別の方法は、低張性分離後網膜血管です。この組織作製手法で網膜血管と神経細胞の解放されて毛細血管。孤立した網膜血管ネットワークの二次元画像のこのタイプは通常網膜のトリプシン消化20後に実行、糖尿病性網膜症の周皮細胞の損失、毛細血管などの血管異常を評価するために使用変性20,21,22。低張性分離法は、彼らは、RT-PCR および西部のしみが付く23,24,25で行われている網膜血管遺伝子やタンパク質規制対応の調査を提供しています。我々 はここで微小血管を調べるトリプシンの消化力の代替として低張性孤立した網膜血管系の浮動免疫組織化学染色プロトコルを提供します。
Protocol
Representative Results
Discussion
微小血管網膜血管の研究に適用できる 3 つの網膜の調製技術を提案します。以下、それぞれの方法を比較し、プロトコルで重要な手順を強調表示。
網膜は矢状セクションのカットを用いて、電子顕微鏡で、したがって、同じ網膜から多数の標本を得ることが可能です。このメソッドから生じる数字のセクションでは、抗体の特異性と滴定試験動物の不必要な犠牲を防ぐ?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
デンマーク ルンドベック財団によって資金が供給された研究。
Materials
| Geletin from porcine skin | Sigma-Aldrich | G2625-500G | |
| Albumin from chicken egg white | Sigma-Aldrich | A5253-500G | |
| Deoxyribonuclease (DNAse) I from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | D5025-15KU | Dissolved in 0.15 M NaCl |
| Bovine serum albumin (BSA) | VWR | 0332-100G | |
| Normal donkey serum | Jackson ImmunoResearch | 017-000-121, lot 129348 | |
| Rabbit anti-PDGFRβ | Santa Cruz | sc-432 | 1:100 |
| Mouse anti-NG2 | Abcam | ab50009 | 1:500 |
| Alexa Fluor 594 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG | Jackson ImmunoResearch | 711-585-152 | 1:100 |
| Fluorescein (FITC) AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 715-095-151 | 1:100 |
| Cy2 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 711-225-152 | 1:100 |
| Cy3 AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 715-165-150 | 1:100 |
| 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Sigma-Aldrich | D9542-1MG | Dissolved in DMSO |
| Anti-fading mounting medium | Vector Laboratories | H-1000 | |
| Anti-fading mounting medium with DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | |
| Nunc Lab-Tek II 4-well chamber slide | Thermo Fisher Scientific | 154526 |
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