Netthinnen Cryo-deler, hele-monteringer, og hypotonisk isolert blodkar forberedelser for Immunohistochemical visualisering av mikrovaskulær Pericytes
Summary
Viser vi tre ulike vev forberedelser teknikker for immunohistochemical visualisering av rotte retinal mikrovaskulær pericytes, dvs. cryo-partiene, hele-montere og hypotonisk isolasjon av vaskulære nettverket.
Abstract
Netthinnen pericytes spiller en viktig rolle i mange sykdommer i øyet. Immunohistochemical flekker teknikker av netthinnen fartøy og mikrovaskulær er pericytes sentrale i ophthalmological forskning. Det er viktig å velge en passende metode for å visualisere mikrovaskulær pericytes. Vi beskriver retinal mikrovaskulær pericyte immunohistochemical farging i cryo-inndelinger, hele-montere og hypotonisk isolert blodkar bruker antistoffer for blodplater-avledet vekst faktor reseptor β (PDGFRβ) og nerve/glial antigen 2 (NG2). Dette tillater oss å markere fordeler og svakheter av hver av de tre vev forberedelsene for visualisering av netthinnen mikrovaskulær pericytes. Cryo-deler gir transsectional visualisering av alle retinal lag, men inneholder bare noen sporadiske tverrgående kutt av microvasculature. Hele-mount gir en oversikt over det hele retinal blodkar, men visualisering av microvasculature kan være plagsom. Hypotonisk isolasjon gir en metode for å visualisere hele retinal blodkar ved fjerning av neuronal celler, men dette gjør vevet svært skjøre.
Introduction
Netthinnen pericytes er fokus for mange forskningslaboratorier som disse cellene spille en viktig rolle i integritet er blodkar. Patologiske tilstander som diabetisk retinopati1, iskemi2og glaukom3 har vaskulære egenskaper som involverer funksjonen til pericytes. Pericytes finnes i de indre retinal kapillært plexuses. Den sentral retinal arterien som leverer indre netthinnen hopper inn i to lag av kapillær plexuses. Indre vaskulær sengen ligger mellom ganglion celle- og indre kjernefysiske lag. De dypere lag er mer tett og komplekse og er lokalisert mellom indre og ytre kjernefysiske lag4,5. I tillegg inneholde deler av netthinnen også en tredje nettverk kalt radial parapapillary kapillærene. Disse er lange, rette kapillærene som ligger blant nervefibrene og sjelden anastomose med hverandre eller andre to plexuses6. I kapillær veggen, pericytes er innebygd i kjelleren membranen og linje abluminal siden av vaskulær endotelceller.
Til denne datoen er det ingen unik biologiske markør for disse pericytes som kan skille dem fra andre vaskulære celler. Blodplater-avledet vekst faktor reseptor β (PDGFRβ) og nerve/glial antigen 2 (NG2) er vanlige markører som begge presenterer på pericytes men også andre vaskulære celler. Identifikasjon av pericytes kompliseres ytterligere av eksistensen av pericyte delsett som varierer i morfologi og protein uttrykk7. Foreløpig bruker best identifikasjon en kombinasjon av protein markører og karakteristiske plasseringen av pericyte i vaskulære veggen. Her viser vi tre ulike vev forberedelser teknikker for immunohistochemical PDGFRβ/NG2 farging av rotte retinal mikrovaskulær pericytes, dvs., cryo-partiene, hele-montere og hypotonisk isolasjon av vaskulære nettverket.
I cryo-deler skjære netthinnen og sclera gjennom den optiske nerven. Dette gir visualisering av alle lag strukturer av neurons. De forskjellige ti lag av netthinnen er som interchanging kjernefysiske og axonal/dendrittiske strukturer som kan visualiseres med flekker som hematoxylin/eosin eller fluorescerende kjernefysiske 4′, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)8. Metabolsk kravene varierer mellom lag9 , og det gir en metode for å fastslå tykkelse eller totalt fravær av et bestemt lag (f.ekstap av netthinnen ganglieceller er ett av kjennetegnene på netthinnen iskemi10, 11). Er blodkar er tydelig som tverrgående skjærer gjennom netthinnen, som gjør det mulig å studere separat kapillært plexuses i de respektive retinal lag12,13.
Mer tradisjonelt utføres undersøkelser av netthinnen blodkar nettverk retinal hele-monteringer. Med dette vev preparatet, er netthinnen kuttet og flat som en blomst-formet struktur. Metoden er en relativt rask vev forberedelse teknikk som kan fremheve den generelle arkitekturen retinal blodkar og det er derfor ofte brukt i etterforskningen av neovascularization i murine netthinnen. Vellykket visualisering av microvasculature i hele montert Netthinne rapporteres også i utviklingsland neonatal musen og rotten netthinnen14,15,16,17,18, 19. disse studiene avsløre en mer definert pericytic aktivitet med større kapillær-fri områder i voksen sammenlignet med den nyfødte Netthinne14.
En annen måte å visualisere er netthinnen microvasculature etter hypotonisk isolasjon. Denne vev forberedelse teknikken resulterer i netthinnen blodårer og blodkar frigjort neuronal cellene. Denne typen todimensjonal avbilding av isolerte retinal vaskulære nettverket er vanligvis utført etter retinal trypsin fordøyelsen20 og brukes til å vurdere den vaskulære unormalt diabetisk retinopati inkludert pericyte tap og kapillær degenerasjon20,21,22. Metoden hypotonisk isolasjon tilbyr undersøkelser av netthinnen vaskulær genet og protein regulatoriske svar som de har blitt gjort med RT PCR og vestlige blotting23,24,25. Vi gir her en protokoll for fri-flyt immunohistochemical farging av er hypotonisk isolert retinal blodkar som et alternativ til trypsin fordøyelsen undersøke mikrovaskulær pericytes.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vi presenterer tre retinal forberedelser teknikker som kan brukes i studiet av mikrovaskulær retinal pericytes. Nedenfor vi tilbyr en sammenligning mellom hver av metodene og markere avgjørende skritt i protokoller.
Med cryo-snitting netthinnen er kuttet i sagittal deler og derfor er det mulig å få mange eksemplarer fra samme netthinnen. Numeriske delene som følge av denne metoden gjør det et ideelt valg for antistoff spesifisitet og titrering testing som det forhindrer unødvendige dyr …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forskningen ble finansiert av The Lundbeck Foundation, Danmark.
Materials
| Geletin from porcine skin | Sigma-Aldrich | G2625-500G | |
| Albumin from chicken egg white | Sigma-Aldrich | A5253-500G | |
| Deoxyribonuclease (DNAse) I from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | D5025-15KU | Dissolved in 0.15 M NaCl |
| Bovine serum albumin (BSA) | VWR | 0332-100G | |
| Normal donkey serum | Jackson ImmunoResearch | 017-000-121, lot 129348 | |
| Rabbit anti-PDGFRβ | Santa Cruz | sc-432 | 1:100 |
| Mouse anti-NG2 | Abcam | ab50009 | 1:500 |
| Alexa Fluor 594 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG | Jackson ImmunoResearch | 711-585-152 | 1:100 |
| Fluorescein (FITC) AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 715-095-151 | 1:100 |
| Cy2 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 711-225-152 | 1:100 |
| Cy3 AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 715-165-150 | 1:100 |
| 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Sigma-Aldrich | D9542-1MG | Dissolved in DMSO |
| Anti-fading mounting medium | Vector Laboratories | H-1000 | |
| Anti-fading mounting medium with DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | |
| Nunc Lab-Tek II 4-well chamber slide | Thermo Fisher Scientific | 154526 |
Referências
- Eshaq, R. S., Aldalati, A. M. Z., Alexander, J. S., Harris, N. R. Diabetic retinopathy: Breaking the barrier. Pathophysiology. , (2017).
- Cai, W., et al. Pericytes in Brain Injury and Repair After Ischemic Stroke. Translational Stroke Research. , (2016).
- Trost, A., et al. Brain and Retinal Pericytes: Origin, Function and Role. Frontiers in Cellular Neuroscience. 10, 20 (2016).
- Ramos, D., Lagali, N., et al. The Use of Confocal Laser Microscopy to Analyze Mouse Retinal Blood Vessels. Confocal Laser Microscopy – Principles and Applications in Medicine, Biology, and the Food Sciences. , (2013).
- Moran, E. P., et al. Neurovascular cross talk in diabetic retinopathy: Pathophysiological roles and therapeutic implications. American Journal of Physiology. Heart and Circulatory Physiolog. 311, H738-H749 (2016).
- Henkind, P. Microcirculation of the peripapillary retina. Transactions – American Academy of Ophthalmology and Otolaryngology. 73, 890-897 (1969).
- Attwell, D., Mishra, A., Hall, C. N., O’Farrell, F. M., Dalkara, T. What is a pericyte?. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 36, 451-455 (2016).
- Fernandez-Bueno, I., et al. Histologic Characterization of Retina Neuroglia Modifications in Diabetic Zucker Diabetic Fatty Rats. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 58, 4925-4933 (2017).
- Yu, D. -. Y., Yu, P. K., Cringle, S. J., Kang, M. H., Su, E. -. N. Functional and morphological characteristics of the retinal and choroidal vasculature. Progress in Retinal and Eye Research. 40, 53-93 (2014).
- Allen, R. S., et al. Severity of middle cerebral artery occlusion determines retinal deficits in rats. Experimental Neurology. 254, 206-215 (2014).
- Kyhn, M. V., et al. Acute retinal ischemia caused by controlled low ocular perfusion pressure in a porcine model. Electrophysiological and histological characterisation. Experimental Eye Research. 88, 1100-1106 (2009).
- Blixt, F. W., Radziwon-Balicka, A., Edvinsson, L., Warfvinge, K. Distribution of CGRP and its receptor components CLR and RAMP1 in the rat retina. Experimental Eye Research. 161, 124-131 (2017).
- Sarlos, S., Wilkinson-Berka, J. L. The renin-angiotensin system and the developing retinal vasculature. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 46, 1069-1077 (2005).
- Wittig, D., Jaszai, J., Corbeil, D., Funk, R. H. W. Immunohistochemical localization and characterization of putative mesenchymal stem cell markers in the retinal capillary network of rodents. Cells Tissues Organs. 197, 344-359 (2013).
- Tual-Chalot, S., Allinson, K. R., Fruttiger, M., Arthur, H. M. Whole mount immunofluorescent staining of the neonatal mouse retina to investigate angiogenesis in vivo. Journal of Visualized Experiments. , e50546 (2013).
- Park, D. Y., et al. Plastic roles of pericytes in the blood-retinal barrier. Nature Communications. 8, 15296 (2017).
- Hughes, S., Chan-Ling, T. Characterization of smooth muscle cell and pericyte differentiation in the rat retina in vivo. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 45, 2795-2806 (2004).
- Lange, C., et al. Intravitreal injection of the heparin analog 5-amino-2-naphthalenesulfonate reduces retinal neovascularization in mice. Experimental Eye Research. 85, 323-327 (2007).
- Higgins, R. D., et al. Diltiazem reduces retinal neovascularization in a mouse model of oxygen induced retinopathy. Current Eye Research. 18, 20-27 (1999).
- Chou, J. C., Rollins, S. D., Fawzi, A. A. Trypsin digest protocol to analyze the retinal vasculature of a mouse model. Journal of Visualized Experiments. , e50489 (2013).
- Hazra, S., et al. Liver X receptor modulates diabetic retinopathy outcome in a mouse model of streptozotocin-induced diabetes. Diabetes. 61, 3270-3279 (2012).
- Zhang, L., Xia, H., Han, Q., Chen, B. Effects of antioxidant gene therapy on the development of diabetic retinopathy and the metabolic memory phenomenon. Graefe’s Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 253, 249-259 (2015).
- Dagher, Z., et al. Studies of rat and human retinas predict a role for the polyol pathway in human diabetic retinopathy. Diabetes. 53, 2404-2411 (2004).
- Navaratna, D., McGuire, P. G., Menicucci, G., Das, A. Proteolytic degradation of VE-cadherin alters the blood-retinal barrier in diabetes. Diabetes. 56, 2380-2387 (2007).
- Gustavsson, C., et al. Vascular cellular adhesion molecule-1 (VCAM-1) expression in mice retinal vessels is affected by both hyperglycemia and hyperlipidemia. PLoS One. 5, e12699 (2010).
- Kornfield, T. E., Newman, E. A. Regulation of blood flow in the retinal trilaminar vascular network. Journal of Neuroscience. 34, 11504-11513 (2014).
- Puro, D. G. Retinovascular physiology and pathophysiology: new experimental approach/new insights. Progress in Retinal and Eye Research. 31, 258-270 (2012).
