Retinales crio-secciones, montajes de todo y vasculatura aislado hipotónica preparados para la visualización de Immunohistochemical del pericitos microvasculares
Summary
Demostrar técnicas de preparación de tres tejidos diferentes para la visualización de immunohistochemical del pericitos microvasculares retina de rata, es decir, cryo-secciones, todo-montajes e hipotónica aislamiento de la red vascular.
Abstract
Pericitos retinianos juegan un papel importante en muchas enfermedades del ojo. Immunohistochemical que manchaba técnicas de vasos retinianos y microvascular pericitos son fundamentales para la investigación oftalmológica. Es vital elegir un método apropiado de visualización del pericitos microvasculares. Describimos pericyte microvascular retiniana immunohistochemical que manchaba en cryo-secciones, todo-montajes e hipotónica vasculatura aislado usando los anticuerpos para el antígeno del nervio/glial 2 (NG2) y β del receptor de factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGFRβ). Esto nos permite destacar ventajas y deficiencias de cada una de las preparaciones de tres tejido para la visualización del pericitos microvasculares retinianas. Cryo-secciones proporcionan visualización de transsectional de todas las capas retinianas pero contienen sólo unos ocasionales cortes transversales de la microvascularización. Montaje en conjunto proporciona una visión general de la vasculatura retiniana completa y visualización de la microcirculación puede ser problemática. Hipotónica aislamiento proporciona un método para visualizar la vasculatura retiniana toda por la eliminación de las células neuronales, pero esto hace que el tejido muy frágil.
Introduction
Pericitos retinianos son el foco de muchos laboratorios de investigación como estas células desempeñan un papel importante en la integridad de la vasculatura. Condiciones patológicas tales como la retinopatía diabética1, isquemia2y glaucoma3 tienen características vasculares que implican la función del pericitos. Pericitos se encuentran en los plexos capilares retinianos internos. Ramas de la arteria central de la retina que suministra la retina interna en dos capas de plexos capilares. El lecho vascular interno se encuentra entre la célula del ganglio y las capas nucleares internas. La capa más profunda es más densa y compleja y se localiza entre las capas nucleares interna y externa4,5. Además, algunas partes de la retina contienen también una tercera cadena denominada los capilares parapapillary radial. Estos son largos, tubos capilares rectos que se encuentran entre las fibras nerviosas y raramente los anastomose con uno con el otro o los otros dos plexos6. Dentro de la pared capilar, pericitos están incrustadas en la membrana del sótano y la línea del lado abluminal de células endoteliales vasculares.
Hasta la fecha, no existe ningún marcador biológico único de estos pericitos que puede distinguir de otras células vasculares. Β del receptor de factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGFRβ) y el antígeno del nervio/glial 2 (NG2) son marcadores utilizados que presentan en pericitos pero también otras células vasculares. Identificación del pericitos se complica aún más por la existencia de pericyte subconjuntos que varían en morfología y proteína expresión7. Actualmente, la mejor identificación se basa en una combinación de marcadores de proteínas y la característica de la pericyte en la pared vascular. Aquí demostramos tres técnicas de preparación de tejidos diferentes para la coloración immunohistochemical PDGFRβ/NG2 del pericitos microvasculares retina de rata, es decir, cryo-secciones, todo-montajes y aislamiento hipotónica de la red vascular.
Con secciones de cryo, la retina y la esclerótica se cortan a través del nervio óptico. Esto permite la visualización de todas las estructuras de capas de neuronas. Las diez distintas capas de la retina son evidentes como intercambio de estructuras nucleares y axonal/dendríticas que pueden visualizarse con tinciones como hematoxilina/eosina o fluorescente nuclear 4′, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)8. Las necesidades metabólicas difieren entre las capas9 y ofrece un método para determinar el grueso o total ausencia de una capa específica (por ejemplo, la pérdida de células ganglionares de la retina es una de las características de la isquemia retiniana10, 11). La vasculatura es evidente como transversal atraviesa la retina, lo que es posible estudiar por separado los plexos capilares dentro de las respectivas capas retinianas12,13.
Más tradicionalmente, se realizan las investigaciones de la red de la vasculatura retiniana en retina de monturas de todo. Con esta preparación de tejido, la retina se corta y aplanada como una estructura en forma de flor. El método es una técnica de preparación de tejido relativamente rápido que se puede destacar la vasculatura retiniana de arquitectura general y por lo tanto se aplica a menudo en la investigación de neovascularización de la retina murina. Visualización exitosa de la microvascularización en retinas todo montado también se divulga en el ratón neonatal en desarrollo y14,de retina de rata15,de17,de16,18, 19. estos estudios revelan una actividad pericytic más definida con áreas libre de capilares más grandes en el adulto frente a los los neonatal retina14.
Otra forma de visualizar es la microvasculatura retiniana después aislamiento hipotónica. Esta técnica de preparación de tejido resulta en vasos sanguíneos retinianos y capilares liberados de las células neuronales. Este tipo de proyección de imagen de dos dimensiones de la red vascular retiniana aislada es generalmente realizada después de la digestión de tripsina retina20 y utilizado para evaluar las anormalidades vasculares de la retinopatía diabética como pericyte pérdida capilar degeneración20,21,22. El método de aislamiento hipotónica ofrece las investigaciones de gen vascular retiniana y proteínas reguladoras respuestas como lo ha hecho con la RT-PCR y western blot23,24,25. Aquí proporcionamos un protocolo para el flotador libre de la coloración de immunohistochemical de la vasculatura retiniana aislada hipotónica como alternativa a la digestión de la tripsina para examinar del pericitos microvasculares.
Protocol
Representative Results
Discussion
Presentamos tres técnicas retiniana que pueden ser aplicadas en el estudio del pericitos retinianos microvasculares. A continuación, ofrecemos una comparación entre cada uno de los métodos y resaltar los pasos críticos en los protocolos.
Con el seccionamiento de cryo, la retina se corta en secciones sagitales y por lo tanto, es posible obtener numerosas muestras de la misma retina. Las secciones números resultantes de este método lo hacen una opción ideal para la especificidad de antic…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
La investigación fue financiada por la Fundación Lundbeck, Dinamarca.
Materials
| Geletin from porcine skin | Sigma-Aldrich | G2625-500G | |
| Albumin from chicken egg white | Sigma-Aldrich | A5253-500G | |
| Deoxyribonuclease (DNAse) I from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | D5025-15KU | Dissolved in 0.15 M NaCl |
| Bovine serum albumin (BSA) | VWR | 0332-100G | |
| Normal donkey serum | Jackson ImmunoResearch | 017-000-121, lot 129348 | |
| Rabbit anti-PDGFRβ | Santa Cruz | sc-432 | 1:100 |
| Mouse anti-NG2 | Abcam | ab50009 | 1:500 |
| Alexa Fluor 594 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG | Jackson ImmunoResearch | 711-585-152 | 1:100 |
| Fluorescein (FITC) AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 715-095-151 | 1:100 |
| Cy2 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 711-225-152 | 1:100 |
| Cy3 AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 715-165-150 | 1:100 |
| 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Sigma-Aldrich | D9542-1MG | Dissolved in DMSO |
| Anti-fading mounting medium | Vector Laboratories | H-1000 | |
| Anti-fading mounting medium with DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | |
| Nunc Lab-Tek II 4-well chamber slide | Thermo Fisher Scientific | 154526 |
Referências
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