Retinal Cryo-sektioner, hela-fästen och hypoton isolerade vaskulatur förberedelserna inför immunhistokemisk visualisering av mikrovaskulära pericyter
Summary
Vi visar tre tekniker för beredning av olika vävnad för immunhistokemiska visualisering av råtta retinal mikrovaskulära pericyter, dvs cryo-avsnitt, hela-fästen och hypoton isolering av vaskulära nätverket.
Abstract
Retinal pericyter har en viktig roll vid många sjukdomar i ögat. Immunohistokemisk färgningsteknik av retinala kärl och mikrovaskulära är pericyter centrala för oftalmologisk forskning. Det är viktigt att välja en lämplig metod att visualisera de mikrovaskulära pericyter. Vi beskriver retinal mikrovaskulära pericyt immunhistokemisk färgning i cryo-avsnitt, hela-fästen och hypoton isolerade vaskulatur använder antikroppar för trombocyt-härrör tillväxtfaktor receptor β (PDGFRβ) och nerv/gliaceller antigen 2 (NG2). Detta tillåter oss att belysa fördelar och brister av varje av de tre vävnad förberedelserna för visualisering av den retinala mikrovaskulära pericyter. Cryo-avsnitten ger transsectional visualisering av alla retinala lager men innehåller endast några enstaka tvärgående nedskärningar av mikrocirkulation. Hela-mount ger en översikt över den hela retinala kärl, men visualisering av mikrocirkulation kan vara besvärande. Hypoton isolering ger en metod för att visualisera den hela retinala blodkärlen genom avlägsnande av neuronala celler, men detta gör vävnaden mycket bräcklig.
Introduction
Retinal pericyter är i fokus för många forskningslaboratorier som dessa celler spelar en viktig roll i integriteten av kärlsystemet. Sjukdomstillstånd såsom diabetesretinopati1, ischemi2och glaukom3 har vaskulära egenskaper som involverar funktionen av pericyter. Pericyter finns i de inre retinal kapillär plexuses. Den centrala retinal artär som förser inre näthinnan grenarna i två lager av kapillär plexuses. Inre vaskulär sängen ligger mellan ganglion cell och inre nukleära lager. Det djupa lagret är mer tät och komplex och är lokaliserad mellan den inre och yttre nukleära lager4,5. Dessutom innehåller vissa delar av näthinnan också ett tredje nätverk som kallas radiell parapapillary kapillärerna. Dessa är långa, raka kapillärer som ligger bland nervfibrerna och sällan anastomose med varandra eller de andra två plexuses6. Inom kapillär väggen, pericyter är inbäddade i basalmembranet och linje abluminal sidan av vaskulära endotelceller.
Till detta datum finns det ingen unik biologisk markör av dessa pericyter som kan skilja dem från andra vaskulära celler. Trombocyt-härrör tillväxtfaktor receptor β (PDGFRβ) och nerv/gliaceller antigen 2 (NG2) är vanliga markörer som båda presenterar på pericyter men också andra vaskulära celler. Identifiering av pericyter kompliceras ytterligare av förekomsten av pericyt delmängder som varierar i morfologi och protein uttryck7. För närvarande bygger bästa identifieringen på en kombination av protein markörer och karakteristiska placeringen av pericyt i kärlväggen. Här visar vi tre tekniker för beredning av olika vävnad för immunhistokemiska PDGFRβ/NG2 färgning av råtta retinal mikrovaskulära pericyter, dvs, cryo-avsnitt, hela-fästen och hypoton isolering av vaskulära nätverket.
Med kryo-sektioner skärs näthinnan och sklera genom synnerven. Detta möjliggör visualisering av alla skiktade strukturer av nervceller. De distinkta tio lagrarna av näthinnan är uppenbara som utbyta kärn- och axonal/dendritiska strukturer som kan visualiseras med fläckar såsom hematoxylin/eosin eller fluorescerande nukleära 4′, 6-diamidin-2-fenylindol (DAPI)8. De metabola krav skiljer sig mellan de lager9 och det ger en metod för att bestämma tjocklek eller total avsaknad av ett visst lager (t.ex., förlusten av retinala ganglionceller är ett av kännetecknen av retinal ischemi10, 11). I kärlsystemet är uppenbart eftersom tvärgående skär genom näthinnan, vilket gör det möjligt att separat studera de kapillära plexuses inom de respektiva retinal lager12,13.
Mer traditionellt, utförs utredningarna av retinal vaskulatur nätverket i näthinnans hela-fästen. Med denna vävnad förberedelse, näthinnan skärs och tillplattad som en blomma-formad struktur. Metoden är en relativt snabb vävnad förberedelse teknik som kan belysa den övergripande arkitekturen retinala blodkärlen och det används därför ofta i utredningen av kärlnybildning i murina näthinnan. Lyckad visualisering av mikrocirkulation i hela monterade näthinnor rapporteras också i utvecklingsländer neonatal mus och råtta näthinnan14,15,16,17,18, 19. dessa studier avslöja en mer definierad pericytic aktivitet med större kapillär-fria områden i den vuxna jämfört med den neonatala näthinna14.
Ett annat sätt att visualisera är den retinala mikrocirkulation efter hypoton isolering. Denna vävnad förberedelse teknik resulterar i näthinnans blodkärl och kapillärer att vara befriad från de neuronala cellerna. Denna typ av tvådimensionell avbildning av det isolerade retinal vaskulär nätverket är vanligtvis utförs efter retinal trypsin matsmältningen20 och används för att bedöma de vaskulära avvikelserna av diabetesretinopati inklusive pericyt förlust och kapillär degeneration20,21,22. Metoden hypoton isolering erbjuder utredningarna av retinala vaskulära genen och protein reglerande svaren som de har gjorts med RT-PCR och western blotting23,24,25. Vi ger här ett protokoll för den fri-float immunhistokemisk färgning av den hypoton isolerade retinala blodkärlen som ett alternativ till trypsin matsmältningen att undersöka de mikrovaskulära pericyter.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vi presenterar tre retinal förberedelser tekniker som kan tillämpas i studien av mikrovaskulära retinal pericyter. Nedan, vi tillhandahåller en jämförelse mellan alla metoder och markera kritiska steg i protokollen.
Med kryo-snittning, näthinnan skärs i sagittal sektioner och därför är det möjligt att få talrika exemplar från samma näthinnan. Avsnitten siffran som följer av denna metod gör det ett idealiskt val för antikropp specificitet och titrering test eftersom den förhi…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forskningen har finansierats av Lundbeck Foundation, Danmark.
Materials
| Geletin from porcine skin | Sigma-Aldrich | G2625-500G | |
| Albumin from chicken egg white | Sigma-Aldrich | A5253-500G | |
| Deoxyribonuclease (DNAse) I from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | D5025-15KU | Dissolved in 0.15 M NaCl |
| Bovine serum albumin (BSA) | VWR | 0332-100G | |
| Normal donkey serum | Jackson ImmunoResearch | 017-000-121, lot 129348 | |
| Rabbit anti-PDGFRβ | Santa Cruz | sc-432 | 1:100 |
| Mouse anti-NG2 | Abcam | ab50009 | 1:500 |
| Alexa Fluor 594 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG | Jackson ImmunoResearch | 711-585-152 | 1:100 |
| Fluorescein (FITC) AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 715-095-151 | 1:100 |
| Cy2 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 711-225-152 | 1:100 |
| Cy3 AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 715-165-150 | 1:100 |
| 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Sigma-Aldrich | D9542-1MG | Dissolved in DMSO |
| Anti-fading mounting medium | Vector Laboratories | H-1000 | |
| Anti-fading mounting medium with DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | |
| Nunc Lab-Tek II 4-well chamber slide | Thermo Fisher Scientific | 154526 |
Referências
- Eshaq, R. S., Aldalati, A. M. Z., Alexander, J. S., Harris, N. R. Diabetic retinopathy: Breaking the barrier. Pathophysiology. , (2017).
- Cai, W., et al. Pericytes in Brain Injury and Repair After Ischemic Stroke. Translational Stroke Research. , (2016).
- Trost, A., et al. Brain and Retinal Pericytes: Origin, Function and Role. Frontiers in Cellular Neuroscience. 10, 20 (2016).
- Ramos, D., Lagali, N., et al. The Use of Confocal Laser Microscopy to Analyze Mouse Retinal Blood Vessels. Confocal Laser Microscopy – Principles and Applications in Medicine, Biology, and the Food Sciences. , (2013).
- Moran, E. P., et al. Neurovascular cross talk in diabetic retinopathy: Pathophysiological roles and therapeutic implications. American Journal of Physiology. Heart and Circulatory Physiolog. 311, H738-H749 (2016).
- Henkind, P. Microcirculation of the peripapillary retina. Transactions – American Academy of Ophthalmology and Otolaryngology. 73, 890-897 (1969).
- Attwell, D., Mishra, A., Hall, C. N., O’Farrell, F. M., Dalkara, T. What is a pericyte?. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 36, 451-455 (2016).
- Fernandez-Bueno, I., et al. Histologic Characterization of Retina Neuroglia Modifications in Diabetic Zucker Diabetic Fatty Rats. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 58, 4925-4933 (2017).
- Yu, D. -. Y., Yu, P. K., Cringle, S. J., Kang, M. H., Su, E. -. N. Functional and morphological characteristics of the retinal and choroidal vasculature. Progress in Retinal and Eye Research. 40, 53-93 (2014).
- Allen, R. S., et al. Severity of middle cerebral artery occlusion determines retinal deficits in rats. Experimental Neurology. 254, 206-215 (2014).
- Kyhn, M. V., et al. Acute retinal ischemia caused by controlled low ocular perfusion pressure in a porcine model. Electrophysiological and histological characterisation. Experimental Eye Research. 88, 1100-1106 (2009).
- Blixt, F. W., Radziwon-Balicka, A., Edvinsson, L., Warfvinge, K. Distribution of CGRP and its receptor components CLR and RAMP1 in the rat retina. Experimental Eye Research. 161, 124-131 (2017).
- Sarlos, S., Wilkinson-Berka, J. L. The renin-angiotensin system and the developing retinal vasculature. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 46, 1069-1077 (2005).
- Wittig, D., Jaszai, J., Corbeil, D., Funk, R. H. W. Immunohistochemical localization and characterization of putative mesenchymal stem cell markers in the retinal capillary network of rodents. Cells Tissues Organs. 197, 344-359 (2013).
- Tual-Chalot, S., Allinson, K. R., Fruttiger, M., Arthur, H. M. Whole mount immunofluorescent staining of the neonatal mouse retina to investigate angiogenesis in vivo. Journal of Visualized Experiments. , e50546 (2013).
- Park, D. Y., et al. Plastic roles of pericytes in the blood-retinal barrier. Nature Communications. 8, 15296 (2017).
- Hughes, S., Chan-Ling, T. Characterization of smooth muscle cell and pericyte differentiation in the rat retina in vivo. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 45, 2795-2806 (2004).
- Lange, C., et al. Intravitreal injection of the heparin analog 5-amino-2-naphthalenesulfonate reduces retinal neovascularization in mice. Experimental Eye Research. 85, 323-327 (2007).
- Higgins, R. D., et al. Diltiazem reduces retinal neovascularization in a mouse model of oxygen induced retinopathy. Current Eye Research. 18, 20-27 (1999).
- Chou, J. C., Rollins, S. D., Fawzi, A. A. Trypsin digest protocol to analyze the retinal vasculature of a mouse model. Journal of Visualized Experiments. , e50489 (2013).
- Hazra, S., et al. Liver X receptor modulates diabetic retinopathy outcome in a mouse model of streptozotocin-induced diabetes. Diabetes. 61, 3270-3279 (2012).
- Zhang, L., Xia, H., Han, Q., Chen, B. Effects of antioxidant gene therapy on the development of diabetic retinopathy and the metabolic memory phenomenon. Graefe’s Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 253, 249-259 (2015).
- Dagher, Z., et al. Studies of rat and human retinas predict a role for the polyol pathway in human diabetic retinopathy. Diabetes. 53, 2404-2411 (2004).
- Navaratna, D., McGuire, P. G., Menicucci, G., Das, A. Proteolytic degradation of VE-cadherin alters the blood-retinal barrier in diabetes. Diabetes. 56, 2380-2387 (2007).
- Gustavsson, C., et al. Vascular cellular adhesion molecule-1 (VCAM-1) expression in mice retinal vessels is affected by both hyperglycemia and hyperlipidemia. PLoS One. 5, e12699 (2010).
- Kornfield, T. E., Newman, E. A. Regulation of blood flow in the retinal trilaminar vascular network. Journal of Neuroscience. 34, 11504-11513 (2014).
- Puro, D. G. Retinovascular physiology and pathophysiology: new experimental approach/new insights. Progress in Retinal and Eye Research. 31, 258-270 (2012).
