Produktionen av Elastin-liknande Protein hydrogeler för inkapsling och immunfärgning av celler i 3D
Summary
Rekombinant protein-engineered hydrogeler är fördelaktiga för 3D cellkultur eftersom de tillåter för komplett tunability av polymeren ryggraden och därför den cell mikromiljö. Här beskriver vi processen för rekombinant elastin-liknande protein rening och dess tillämpning i 3D hydrogel cell inkapsling.
Abstract
Tvådimensionell (2D) vävnadsodling tekniker har varit avgörande för vår förståelse av grundläggande cellbiologi. Dock samlas traditionella 2D vävnadsodling system brist en tredimensionell (3D)-matris, vilket resulterar i en betydande klyfta mellan resultat in vitro- och in vivo. För att lösa denna begränsning, har forskare konstruerade 3D hydrogel vävnadsodling plattformar som kan härma den biokemiska och biofysiska egenskaper för den i vivo cell mikromiljö. Denna forskning har motiverat behovet av att utveckla material plattformar som stöder 3D cell inkapsling och nedströms biokemiska analyser. Rekombinant protein engineering erbjuder en unik verktygsuppsättning för 3D hydrogel materialdesign och utveckling genom att tillåta specifik kontroll av proteinsekvens och därmed, i förlängningen, de eventuella mekaniska och biokemiska egenskaperna av resultanten Matrix. Här presenterar vi ett protokoll för uttrycket av recombinantly-derived elastin-liknande protein (ELP), som kan användas till formuläret hydrogels med självständigt avstämbara mekaniska egenskaper och cell-självhäftande ligand koncentration. Vi presenterar ytterligare en metod för cell inkapsling inom ELP hydrogels och efterföljande Immunofluorescerande färgning av inbäddade celler för efterföljande analys och kvantifiering.
Introduction
Under det senaste århundradet, har tvådimensionell (2D) vävnadskultur utvecklats till en integrerad verktygsuppsättning för att studera grundläggande cellbiologi i vitro. Dessutom har relativt låg kostnad och enkel protokollen för 2D cellkultur lett till antagandet i många biologiska och medicinska discipliner. Tidigare forskning har dock visat att traditionella 2D plattformar kan leda till resultat att avvika markant från de insamlade i vivo, orsakar dyrbar tid och medel slösas bort för kliniskt inriktad forskning1,2, 3. Vi och andra hypotes att denna diskrepans kan tillskrivas bristen på inhemska biokemiska och biofysiska ledtrådar till cellerna odlade på 2D ytor, som kan vara nödvändiga för optimal spridning och mognaden av olika celltyper.
För att hantera dessa begränsningar och hjälp överbryggar klyftan mellan 2D har in vitro- och in-vivo studier, forskarna utvecklat tredimensionella (3D) hydrogel plattformar för cell-inkapsling1,4,5 ,6. Hydrogeler är perfekt material att sammanfatta den endogena mikromiljö av extracellulär matrix (ECM) i vivo på grund av deras vävnad-liknande mekaniska egenskaper och vatten-svullna struktur som möjliggör snabb transport av näringsämnen och signalering faktorer7,8. Dessutom kan 3D hydrogels utformas oberoende kontroll över mekaniska och biokemiska egenskaper av ställningen. Både matrix mekanik9,10,11,12 och cell-självhäftande ligander13,14,15 är kända att påverka cell beteende i vitro och invivo. Således, 3D hydrogels med avstämbara boenden erbjuder en plattform för att studera de kausala relationerna mellan celler och deras mikromiljö. Kriterierna för en perfekt 3D hydrogel matris innehålla enkla, icke-cytotoxiska celler-inkapsling samt oberoende tunability av fysiologiskt relevanta mekaniska egenskaper och härmar av infödda cell-självhäftande motiv.
Både syntetiska (t.ex., polyetylenglykol, polymjölksyra, poly (glykolsyra)) och naturligt framställda (t.ex., alginat, kollagen, Matrigel) hydrogeler har fördelar jämfört med 2D i vitro kultur plattformar; de har dock även betydande brister som begränsar deras användbarhet. Första, många syntetiskt och naturligt framställda plattformar kräver hårda crosslinking förhållanden som kan vara potentiellt giftiga för däggdjursceller, vilket leder till minskade cell lönsamhet7. Dessutom många syntetiska plattformar saknar infödda bioaktivitet och behöver vara functionalized sekundära kemiska reaktioner, som kan lägga ökad kostnad och komplexitet16. Slutligen, medan naturligt framställda material innehåller vanligtvis inneboende bio-aktiva domäner, de är ofta plågas av hög sats till sats variabilitet och ofta är begränsade till bildar relativt svag geler7,17.
Rekombinant protein engineering presenterar en unik verktygslåda för materialdesign genom att explicit kontroll över proteinsekvens och, i förlängningen, de eventuella mekaniska och biokemiska egenskaperna hos den slutliga hydrogel schavotten18. Dessutom, genom att utnyttja den välkända biologiska maskinen av Escherichia coli (E. coli) att uttrycka proteiner, kan material produceras kostnadseffektivt och konsekvent med begränsad inter – och intra-batch variabilitet. Proteinet elastin-liknande (ELP) presenteras här har tre bakåtkompilerade domäner: (1) en T7 och His6-tagg som möjliggör märkning fluorescently taggade antikroppar, (2) en ‘elastin-liknande’ region som ger elastiska mekaniska egenskaper och möjliggör kemiska crosslinking, och (3) en ‘bio-aktiva’ region som kodar för cell-självhäftande motiv.
Vår elastin-liknande region är baserad på den kanoniska (Val-Pro-Gly-Xaa-Gly)5 elastin sekvens där fyra av de ‘Xaa’ aminosyra platser är isoleucin (Ile), men kan vara utformade för att vara någon aminosyra utom prolin. Denna sekvens begåvar rekombinant ELPs med lägre kritisk lösning temperatur (LCST) beteende som kan utnyttjas för enkel rening efter uttryck via termisk cykling19,20. Detta LCST boende kan stämmas till termiskt samlade vid olika temperaturer genom att ändra den gäst ‘Xaa’ rester21,22.
Här, har den ‘Xaa’ positionen på en av de fem elastin-liknande repetitioner ersatts med amine-presenterande lysin (Lys) aminosyran, som utnyttjas för hydrogel crosslinking. Vårt tidigare arbete har visat icke-cytotoxiska och robust crosslinking via reaktion med amine-reaktivt crosslinker tetrakis (hydroximetyl) phosphonium klorid (THPC)23. Av varierande övergripande innehåll och crosslinker proteinkoncentration kan vi producera hydrogels som kan ställas in för att spänna över ett fysiologiskt relevanta stelhet utbud (~0.5-50 kPa)9,23,24. Utöver tuning mekaniska egenskaper, cell adhesion inom hydrogel resultaten från integrationen av kanoniska cell-självhäftande domäner inom ryggraden av proteinet ELP. Till exempel införlivandet av den utökade Fibronektin-härledda ‘RGDS’ aminosyrasekvensen möjliggör celladhesion och konfirmerande flexibilitet, medan den kodade, icke-bindande ‘RDGS’ variant begränsar cell-matrix vidhäftning24. Genom att modulera förhållandet mellan cell-lim till icke-häftande proteiner samt totalprotein koncentrationen, kan vi effektivt producera hydrogels som spänner över ett brett spektrum av liganden koncentration. Resultantly, har vi utvecklat en hydrogel plattform med frikopplat biokemiska och biofysiska egenskaper, som självständigt kan stämmas för optimal 3D kultur av olika celltyper.
Utöver matrix stelhet och självhäftande ligand tunability erbjuder rekombinant hydrogels möjlighet att design specifika materiella nedbrytning profiler, vilket är nödvändigt för cell spridning, spridning och migration inom en 3D sammanhang4 , 9. denna nedbrytning ges av cell utsöndring av proteaser som specifikt inriktar utökade ‘RGDS’9 – eller elastin-liknande sekvens25. ELP hydrogeler har också visat sig stödja de efterföljande biokemiska analyser som är nödvändiga för att studera cellernas viabilitet och funktion inklusive immuncytokemi samt DNA/RNA/protein utvinning för kvantitativa omvänd transkription-polymeras-kedjereaktion (qRT-PCR) och Western blot9. ELP varianter har också använts i ett antal i vivo modeller och är kända för att vara tolereras väl av immunsystemet26.
Sammantaget ELP som en materiell plattform för cell-inkapsling studier ståtar med en mängd fördelar jämfört med syntetiskt eller naturligt framställda material plattformar, som ofta saknar samma grad av biokemiska och biofysiska tunability och reproducerbarhet. Dessutom ELPS enkla och icke-cytotoxiska användning med en mängd olika celltyper (t.ex., chick dorsalrotsganglier ganglier14,24, murina neurala stamceller celler9, mänsklig mesenkymala stamceller27, nötkreatur neonatal kondrocyter28, mänskliga endothelial celler29,30) möjliggör en mer fysiologiskt relevanta modell av endogena 3D ECM jämfört med 2D cellkultur. Häri, presenterar vi ett protokoll för uttrycket av recombinantly-derived, ELPs för användning som en avstämbara hydrogel plattform för 3D cell inkapsling. Vi presenterar ytterligare metoder för nedströms fluorescerande märkning och konfokalmikroskopi inkapslade celler.
Protocol
Representative Results
Discussion
Rekombinant proteinuttryck och rening är ett kraftfullt verktyg att syntetisera biomaterial med hög reproducerbarhet. På grund av i stort sett tillkomsten av kommersialiserade molekylär kloning, kan anpassade rekombinant plasmider köpas från flera leverantörer, vilket avsevärt minskar den tid att arbeta med material som ELPs. Likaså kan plasmider beställas direkt från den ursprungliga lab när det ursprungliga arbetet stöddes av federala kontrakt och det framtida arbetet blir för ideella användning. Den ful…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Författarna tackar T. Palmer och H. Babu (Stanford neurokirurgi) för att tillhandahålla murina NPCs. vektor konst i figur 4 användes och anpassad från Servier medicinska konsten under Creative Commons Attribution 3.0 Unported License (https://creativecommons.org/ licenses/by/3.0/legalcode). En del av detta arbete utfördes på den Stanford Nano delade faciliteter (SNSF), stöds av National Science Foundation under award ECCS-1542152. N.A.S. erkänner stöd från National Institute of General Medical Sciences av National Institutes of Health (32GM 008412). C.M.M. medger stöd från en NIH NRSA pre forskarnivå fellowship (F31 EB020502) och till Siebel Scholars-programmet. SCH erkänner stöd från National Institutes of Health (U19 AI116484 och R21 EB018407), National Science Foundation (DMR 1508006) och California Institute for Regenerative Medicine (RT3-07948). Denna forskning fått finansiering från alliansen för regenerativ rehabiliteringsforskning & utbildning (AR3T), som stöds av Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health och mänsklig utveckling (NICHD), Konjunkturinstitutet Neurologiska sjukdomar och Stroke (NINDS) och nationella institutet för biomedicinsk Imaging och bioteknik (NIBIB) av de National institutionerna of Health under Award nummer P2CHD086843. Innehållet ansvarar enbart för författarna och representerar inte nödvändigtvis åsikter National Institutes of Health.
Materials
| Elastin-Like Protein Expression and Purification | |||
| 10 cm Petri Dishes | Thermo Fisher Scientific | FB0875713 | |
| 70% Ethanol | RICCA Chemical | 2546.70-1 | |
| Ammonium Sulfate | Sigma-Aldrich | A3920-500G | |
| Ampicillin | Thermo Fisher Scientific | BP1760-25G | |
| Bacto Agar | Thermo Fisher Scientific | 9002-18-0 | |
| BL21(DE3)pLysS Competent Cells | Invitrogen | C606003 | |
| Chloramphenicol | Amresco | 0230-100G | |
| Deoxyribonuclease I from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | DN25 | |
| EDTA disodium salt, dihydrate | Thermo Fisher Scientific | O2793-500 | |
| Glycerol | Thermo Fisher Scientific | BP229-4 | |
| Isopropanol | Thermo Fisher Scientific | A451-4 | |
| Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) | Thermo Fisher Scientific | BP1755-10G | |
| Luria Broth | EMD Millipore | 1.10285.5007 | |
| Parafilm | VWR | 52858-000 | |
| Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF) | MP Biomedicals | 195381 | |
| Sodium Chloride | Thermo Fisher Scientific | BP358-212 | |
| Sodium Hydroxide | Sigma-Aldrich | S 8045-1KG | |
| Syringe Filter Unit (0.22 μm) | Millipore | SLGP033RB | |
| Terrific Broth | Millipore | 71754-4 | |
| Tris Base | Thermo Fisher Scientific | BP152-1 | |
| Cell Encapsulation in 3D ELP Hydrogels | |||
| 0.22 μm syringe filters | Millipore | SLGV004SL | |
| 0.5 mm thick silicone sheet | Electron Microscopy Science | 70338-05 | |
| 24-well tissue culture plates | Corning | 353047 | |
| Disposable Biopsy Punch (2 mm) | Integra Miltex | 33-31 | |
| Disposable Biopsy Punch (4 mm) | Integra Miltex | 33-34 | |
| Disposable Biopsy Punch (5 mm) | Integra Miltex | 33-35 | |
| Dulbecco’s phosphate buffered saline (DPBS) | Corning | 21-031-CM | |
| No. 1 12 mm glass coverslips | Thermo Fisher Scientific | 12-545-80 | |
| Tetrakis(hydroxymethyl)phosphonium chloride (THPC) | Sigma-Aldrich | 404861-100ML | |
| 0.5% Tryspin/EDTA | Thermo Fisher | 15400054 | |
| Immunocytochemistry of Cells in 3D ELP Hydrogels | |||
| 16% (w/v) Paraformaldehyde (PFA) | Electron Microscopy Sciences | 15701 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Roche | 3116956001 | |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Molecular Probes | D1306 | |
| Donkey Serum | Lampire Biological Labs | 7332100 | |
| Goat anti-mouse Secondary Antibody (AF488) | Molecular Probes | A-11017 | |
| Goat anti-rabbit Secondary Antibody (AF546) | Molecular Probes | A-11071 | |
| Goat Serum | Gibco | 16210-072 | |
| Mouse Nestin Primary Antibody | BD Pharmingen | 556309 | |
| Mouse Sox2 Primary Antibody | Cell Signaling Technology | 23064S | |
| Nail Polish | Electron Microscopy Sciences | 72180 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100-100ML | |
| Vectashield Hardset Mounting Medium | Vector Labs | H-1400 |
Referências
- Cukierman, E., Pankov, R., Stevens, D. R., Yamada, K. M. Taking Cell-Matrix Adhesions to the Third Dimension. Science. 294 (5547), 1708-1712 (2001).
- Birgersdotter, A., Sandberg, R., Ernberg, I. Gene expression perturbation in vitro-A growing case for three-dimensional (3D) culture systems. Seminars in Cancer Biology. 15 (5), 405-412 (2005).
- Gómez-Lechón, M. J., et al. Long-term expression of differentiated functions in hepatocytes cultured in three-dimensional collagen matrix. Journal of Cellular Physiology. 177 (4), 553-562 (1998).
- Baker, B. M., Chen, C. S. Deconstructing the third dimension – how 3D culture microenvironments alter cellular cues. Journal of Cell Science. 125 (13), 3015-3024 (2012).
- Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. K. The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 8 (10), 839-845 (2007).
- Justice, B. A., Badr, N. A., Felder, R. A. 3D cell culture opens new dimensions in cell-based assays. Drug Discovery Today. 14 (1-2), 102-107 (2009).
- Caliari, S. R., Burdick, J. A. A practical guide to hydrogels for cell culture. Nature Methods. 13 (5), 405-414 (2016).
- Tibbitt, M. W., Anseth, K. S. Hydrogels as extracellular matrix mimics for 3D cell culture. Biotechnology and Bioengineering. 103 (4), 655-663 (2009).
- Madl, C. M., et al. Maintenance of neural progenitor cell stemness in 3D hydrogels requires matrix remodelling. Nature Materials. 16 (12), 1233-1242 (2017).
- Discher, D. E., Janmey, P., Wang, Y. Tissue Cells Feel and Respond to the Stiffness of Their Substrate. Science. 310 (5751), 1139-1143 (2005).
- Sun, Y., Villa-Diaz, L. G., Lam, R. H. W., Chen, W., Krebsbach, P. H., Fu, J. Mechanics Regulates Fate Decisions of Human Embryonic Stem Cells. PLoS ONE. 7 (5), e37178 (2012).
- Ehrbar, M., et al. Elucidating the Role of Matrix Stiffness in 3D Cell Migration and Remodeling. Biophysical Journal. 100 (2), 284-293 (2011).
- Rowlands, A. S., George, P. A., Cooper-White, J. J. Directing osteogenic and myogenic differentiation of MSCs: interplay of stiffness and adhesive ligand presentation. American Journal of Physiology – Cell Physiology. 295 (4), 1037-1044 (2008).
- Lampe, K. J., Antaris, A. L., Heilshorn, S. C. Design of three-dimensional engineered protein hydrogels for tailored control of neurite growth. Acta Biomaterialia. 9 (3), 5590-5599 (2013).
- Kilian, K. A., Mrksich, M. Directing Stem Cell Fate by Controlling the Affinity and Density of Ligand-Receptor Interactions at the Biomaterials Interface. Angewandte Chemie International Edition. 51 (20), 4891-4895 (2012).
- Tse, J. R., Engler, A. J. Preparation of Hydrogel Substrates with Tunable Mechanical Properties. Current Protocols in Cell Biology. , 10.16.1-10.16.16 (2010).
- Hughes, C. S., Postovit, L. M., Lajoie, G. A. Matrigel: A complex protein mixture required for optimal growth of cell culture. Proteomics. 10 (9), 1886-1890 (2010).
- DiMarco, R. L., Heilshorn, S. C. Multifunctional Materials through Modular Protein Engineering. Advanced Materials. 24 (29), 3923-3940 (2012).
- Meyer, D. E., Chilkoti, A. Purification of recombinant proteins by fusion with thermally-responsive polypeptides. Nature Biotechnology. 17 (11), 1112-1115 (1999).
- Aladini, F., Araman, C., Becker, C. F. W. Chemical synthesis and characterization of elastin-like polypeptides (ELPs) with variable guest residues. Journal of Peptide Science. 22 (5), 334-342 (2016).
- McMillan, R. A., Caran, K. L., Apkarian, R. P., Conticello, V. P. High-Resolution Topographic Imaging of Environmentally Responsive, Elastin-Mimetic Hydrogels. Macromolecules. 32 (26), 9067-9070 (1999).
- McMillan, R. A., Conticello, V. P. Synthesis and Characterization of Elastin-Mimetic Protein Gels Derived from a Well-Defined Polypeptide Precursor. Macromolecules. 33 (13), 4809-4821 (2000).
- Chung, C., Lampe, K. J., Heilshorn, S. C. Tetrakis(hydroxymethyl) Phosphonium Chloride as a Covalent Cross-Linking Agent for Cell Encapsulation within Protein-Based Hydrogels. Biomacromolecules. 13 (12), 3912-3916 (2012).
- Romano, N. H., Madl, C. M., Heilshorn, S. C. Matrix RGD ligand density and L1CAM-mediated Schwann cell interactions synergistically enhance neurite outgrowth. Acta Biomaterialia. 11, 48-57 (2015).
- Shah, M., Hsueh, P. Y., Sun, G., Chang, H. Y., Janib, S. M., MacKay, J. A. Biodegradation of elastin-like polypeptide nanoparticles. Protein Science. 21 (6), 743-750 (2012).
- Nettles, D. L., Chilkoti, A., Setton, L. A. Applications of elastin-like polypeptides in tissue engineering. Advanced Drug Delivery Reviews. 62 (15), 1479-1485 (2010).
- Madl, C. M., Heilshorn, S. C. Tyrosine-Selective Functionalization for Bio-Orthogonal Cross-Linking of Engineered Protein Hydrogels. Bioconjugate Chemistry. 28 (3), 724-730 (2017).
- Zhu, D., Wang, H., Trinh, P., Heilshorn, S. C., Yang, F. Elastin-like protein-hyaluronic acid (ELP-HA) hydrogels with decoupled mechanical and biochemical cues for cartilage regeneration. Biomaterials. , 132-140 (2017).
- Madl, C. M., Katz, L. M., Heilshorn, S. C. Bio-Orthogonally Crosslinked, Engineered Protein Hydrogels with Tunable Mechanics and Biochemistry for Cell Encapsulation. Advanced Functional Materials. 26 (21), 3612-3620 (2016).
- Cai, L., Dinh, C. B., Heilshorn, S. C. One-pot synthesis of elastin-like polypeptide hydrogels with grafted VEGF-mimetic peptides. Biomater Sci. 2 (5), 757-765 (2014).
- Straley, K. S., Heilshorn, S. C. Independent tuning of multiple biomaterial properties using protein engineering. Soft Matter. 5 (1), 114-124 (2009).
- Baneyx, F. Recombinant protein expression in Escherichia coli. Current Opinion in Biotechnology. 10 (5), 411-421 (1999).
- Graumann, K., Premstaller, A. Manufacturing of recombinant therapeutic proteins in microbial systems. Biotechnology Journal. 1 (2), 164-186 (2006).
- Tashiro, K., et al. A Synthetic Peptide Containing the IKVAV Sequence from the A Chain of Laminin Mediates Cell Attachment, Migration, and Neurite Outgrowth. Journal of Biological Chemistry. 264 (27), 16174-16182 (1989).
