تحليل وراثية ترانسثيريتين Ala97Ser الوراثية المتعلقة بالداء النشواني
Summary
هنا، نحن نقدم بروتوكولا لتأكيد وجود طفرة نقطة لتشخيص الداء النشواني ترانسثيريتين وراثية، باستخدام Ala97Ser، أن الطفرة المستوطنة الأكثر شيوعاً في تايوان، على سبيل مثال.
Abstract
الاختبارات الجينية هو الاختبار الأكثر موثوقية ترانسثيريتين وراثية تتعلق بالداء النشواني، وينبغي أن يقوم في معظم الحالات من الداء النشواني ترانسثيريتين (أتتر). ATTR مرض نادر ولكن قاتلة مع تعمل غير المتجانسة؛ ولذلك، في بعض الأحيان تأخر التشخيص. ومع تزايد الاهتمام واعتراف أوسع نطاقا في مظاهرة أوائل ATTR، فضلا عن العلاجات الناشئة، اختبار الدراسات التشخيصية الملائمة، بما في ذلك ترانسثيريتين (بعد) الوراثية، للتأكد من الأنواع وبالتالي فمتغيرات أتتر الأساسية لتحسين التشخيص. التحليلات الجينية بوليميريز سلسلة من ردود الفعل (الاسترداد) أساليب تأكيد وجود الطفرات نقطة بعد أسرع بكثير وأكثر أمنا من الطرق التقليدية مثل الجنوب وصمة عار. هنا، علينا أن نظهر تأكيد الوراثية للطفرة Ala97Ser أتتر، أن الطفرة المستوطنة الأكثر شيوعاً في تايوان. يتضمن البروتوكول أربع خطوات رئيسية: جمع عينات الدم كله واستخراج الحمض النووي والتحليل الجيني لجميع exons بعد أربعة مع بكر، وتسلسل الحمض النووي.
Introduction
ترانسثيريتين (بعد) الداء النشواني (أتتر) هو الشكل الأكثر شيوعاً للداء النشواني الجهازية وراثية1، ويمكن أن يكون سببها طفرة موروثة المهيمن جسمية في الجينات ترانسثيريتين (بعد)2. الطفرات بعد زعزعة استقرار هيكل البروتين تيتراميريك ويؤدي إلى الانفصال عن إلى مونومرات أن يعيد إلى ييفات اميلويد2. وكانت الطفرات بعد أميلويدوجينيك أكثر من 1001المبلغ عنها في جميع أنحاء العالم. تأكيد وجود طفرة نقطة بعد التحاليل الجينية بوليميريز سلسلة من ردود الفعل (الاسترداد) أساليب والمزايا بما في ذلك تجنب التعامل مع تحقيقات المسمى إشعاعيا بالمقارنة بوصمة عار الجنوبي3. بكر هو تقنية سريعة، سهلة ورخيصة ويمكن الاعتماد عليها الذي تم تطبيقه في العديد من المجالات في العلوم الحديثة4.
التشخيص المبكر لهذا المرض تقدمية وفادح يشكل تحديا نظراً لتغاير المظهرية لها. مع تزايد اهتمام واعتراف أوسع نطاقا في مظاهرة أوائل ATTR، فضلا عن العلاجات الناشئة5، ولذلك الدراسات التشخيصية الملائمة بما في ذلك الاختبار الوراثي بعد الأهمية الأساسية لتحسين التشخيص. وعلاوة على ذلك، ترتبط طفرات مختلفة مع penetrance مختلفة لسمة، وسن، وأنماط التقدم، شدة المرض، ومتوسط البقاء على قيد الحياة، ونجاعة لزرع الكبد، أو بعد مثبتات2،6، و درجات متفاوتة من مشاركة الجهاز العصبي والقلب، التي لها آثار كبيرة على المشورة الوراثية7،،من89. وإلى جانب ذلك، اختبار وراثية دقيقة للغاية هو الأداة الوحيدة التي تميز نوعين متميزين من ATTR: وراثية (المسخ) ونوع البرية (النموذج غير متحولة، خرف الجهازية الداء النشواني، وزارة الصحة)7. من الضروري التأكد من أنواع أتتر، لأن العلاجات تختلف على نطاق واسع2. ولذلك، ثمة ضرورة متزايدة لوصف البروتوكول التدرجي للاختبار الجيني بعد.
سوف يتضح النهج الجزيئية للكشف عن الطفرات استخدام Ala97Ser، أن الطفرة المستوطنة الأكثر شيوعاً في تايوان، على سبيل مثال. تقليل كمية الحلول الثلاثة تستخدم التعديلات في الخطوة استخراج الحمض النووي وينتج كمية كافية من الحمض النووي. في هذا البروتوكول، حللت جميع exons بعد أربعة، بينما المناطق بما في ذلك 5 ‘المنبع، 3’ المصب، والمروجين، إينترونس، والمناطق غير مترجمة (UTR) كانت غير متسلسلة.
Protocol
Representative Results
Discussion
هناك اثنين من الخطوات الحاسمة ضمن البروتوكول. أولاً، ينبغي أن تكون عينة هيموديلوتيد من أجل الحصول على عدد كاف من خلايا الدم البيضاء، تجنب11. ثانيا، استخدام المناسبة [بكر] كبسولة تفجير أساسي للحصول على نتائج يمكن الاعتماد عليها12. استخدمنا أداة ويب التمهيدي–انفجار …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نود أن نشكر الآنسة وو شين-متعة لمساعدة لها في التجارب. وأيد هذه الدراسة بمنحه من “تشانغ الأمنيون برنامج البحوث الطبية” (CMRPG3C0371، CMRPG3C0372، CMRPG3C0373) والكندي 100-4470A3، 104-2462A3، تايوان.
Materials
| EDTA-treated tubes | BD | ||
| DNA Extraction Kit | Stratagen | 200600 | |
| NanoDrop ND2000 spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | NanoDrop 2000 | |
| Delicate Task Wipers | Kimberly-Clark | Kimtech Science Kimwipes | |
| AmpliTaq Gold 360 DNA Polymerase kit | Applied Biosystems | 4398823 | |
| TTR gene intronic primers | Exon1 | F: 5’-TCAGATTGGCAGGGATAAGC-3’ | |
| Exon1 | R: 5’-GCAAAGCTGGAAGGAGTCAC-3’ | ||
| Exon2 | F: 5’-TCTTGTTTCGCTCCAGATTTC-3’ | ||
| Exon2 | R: 5’-TCTACCAAGTGAGGGGCAAA-3’ | ||
| Exon3 | F: 5’-GTGTTAGTTGGTGGGGGTGT-3’ | ||
| Exon3 | R: 5’-TGAGTAAAACTGTGCATTTCCTG-3’ | ||
| Exon4 | F: 5’-GACTTCCGGTGGTCAGTCAT-3’ | ||
| Exon4 | R: 5’-GCGTTCTGCCCAGATACTTT-3’ | ||
| thermocycler | Applied Biosystems | GeneAmp PCR System 9700 | |
| electrophoresis cell | ADVANCE | Mupid-2plus | |
| DNA ladder | Protech | PT-M1-100 | |
| dye | BioLabs | B7021 | |
| AlphaImager EC | Alpha Innotech | AlphaImager EC | |
| automatic sequencer | Applied Biosystems | 3730xl DNA Analyzer |
Referências
- Planté-Bordeneuve, V., Said, G. Familial amyloid polyneuropathy. The Lancet Neurology. 10 (12), 1086-1097 (2011).
- Planté-Bordeneuve, V., et al. Long-term treatment of transthyretin familial amyloid polyneuropathy with tafamidis: a clinical and neurophysiological study. Journal of Neurology. 264 (2), 268-276 (2017).
- Nichols, W. C., Benson, M. D. Hereditary amyloidosis: detection of variant prealbumin genes by restriction enzyme analysis of amplified genomic DNA sequences. Clinical Genetics. 37 (1), 44-53 (1990).
- Lorenz, T. C. Polymerase Chain Reaction: Basic Protocol Plus Troubleshooting and Optimization Strategies. Journal of Visualized Experiments. (63), e3998 (2012).
- Hsu, H. C., et al. Phenotypic expressions of hereditary Transthyretin Ala97Ser related Amyloidosis (ATTR) in Taiwanese. BMC Neurology. 17 (1), 178 (2017).
- Barroso, F. A., et al. Long-term safety and efficacy of tafamidis for the treatment of hereditary transthyretin amyloid polyneuropathy: results up to 6 years. Amyloid. 24 (3), 194-204 (2017).
- Rapezzi, C., et al. Disease profile and differential diagnosis of hereditary transthyretin-related amyloidosis with exclusively cardiac phenotype: an Italian perspective. European Heart Journal. 34 (7), 520-528 (2013).
- Mariani, L. L., et al. Genotype-phenotype correlation and course of transthyretin familial amyloid polyneuropathies in France. Annals of Neurology. 78 (6), 901-916 (2015).
- Hammarström, P., Jiang, X., Hurshman, A. R., Powers, E. T., Kelly, J. W. Sequence-dependent denaturation energetics: A major determinant in amyloid disease diversity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99, 16427-16432 (2002).
- Johnson, M., Zaretskaya, I., Raytselis, Y., Merezhuk, Y., McGinnis, S., Madden, T. L. NCBI BLAST: a better web interface. Nucleic Acids Research. 36, 5-9 (2008).
- Fox, A. J., et al. Next generation sequencing for the detection of actionable mutations in solid and liquid tumors. Journal of Visualized Experiments. (115), (2016).
- Date, Y., Nakazato, M., Kangawa, K., Shirieda, K., Fujimoto, T., Matsukura, S. Detection of three transthyretin gene mutations in familial amyloidotic polyneuropathy by analysis of DNA extracted from formalin-fixed and paraffin-embedded tissues. Journal of the Neurological Sciences. 150 (2), 143-148 (1997).
- Ye, J., Coulouris, G., Zaretskaya, I., Cutcutache, I., Rozen, S., Madden, T. L. Primer-BLAST: a tool to design target-specific primers for polymerase chain reaction. BMC Bioinformatics. 13, 134 (2012).
- Green, M. R., Sambrook, J. . Molecular cloning: A laboratory manual. , (2012).
- Buckingham, L., Flaws, M. L. . Molecular diagnostics: Fundamentals, methods, and clinical applications. , (2012).
- Tan, S. C., Yiap, B. C. DNA, RNA, and Protein Extraction: The Past and The Present. Journal of Biomedicine and Biotechnology. 2009, (2009).
- Rapezzi, C., et al. Systemic cardiac amyloidoses: disease profiles and clinical courses of the 3 main types. Circulation. 120 (13), 1203-1212 (2009).
- Gertz, M. A., Dispenzieri, A., Sher, T. Pathophysiology and treatment of cardiac amyloidosis. Nature Reviews Cardiology. 12 (2), 91-102 (2015).
- Vrana, J. A., et al. Clinical diagnosis and typing of systemic amyloidosis in subcutaneous fat aspirates by mass spectrometry-based proteomics. Haematologica. 99 (7), 1239-1247 (2014).
- Nakamura, M., et al. Identification of a new transthyretin variant (Ile49) in familial amyloidotic polyneuropathy using electrospray ionization mass spectrometry and nonisotopic RNase cleavage assay. Human Heredity. 49 (4), 186-189 (1999).
- Ueda, M., Ando, Y. Recent advances in transthyretin amyloidosis therapy. Translational Neurodegeneration. 3, 19 (2014).
- Brown, E. E., et al. Genetic testing improves identification of transthyretin amyloid (ATTR) subtype in cardiac amyloidosis. Amyloid. 24 (2), 92-95 (2017).
- Tasaki, M., et al. Rapid detection of wild-type and mutated transthyretins. Annals of Clinical Biochemistry. 53 (4), 508-510 (2015).
- Plante-Bordeneuve, V., et al. Diagnostic pitfalls in sporadic transthyretin familial amyloid polyneuropathy (TTR-FAP). Neurology. 69 (7), 693-698 (2007).
- Hsu, J. L., et al. A prospective, observational study of patients with uncommon distal symmetric painful small-fiber neuropathy. PLoS ONE. 12 (9), 0183948 (2017).
- Salvi, F., Pastorelli, F., Plasmati, R., Bartolomei, I., Dall’Osso, D., Rapezzi, C. Genotypic and phenotypic correlation in an Italian population of hereditary amyloidosis TTR-related (HA-TTR): Clinical and neurophysiological aids to diagnosis and some reflections on misdiagnosis. Amyloid. 19, 58-60 (2012).
- Suhr, O. B., Lundgren, E., Westermark, P. One mutation, two distinct disease variants: Unravelling the impact of transthyretin amyloid fibril composition. Journal of Internal Medicine. 281 (4), 337-347 (2017).
- Vilà-Rico, M., et al. Quantitative analysis of post-translational modifications in human serum transthyretin associated with familial amyloidotic polyneuropathy by targeted LC-MS and intact protein MS. Journal of Proteomics. 127, 234-246 (2015).
