Nous présentons ici un protocole visant à confirmer la présence de mutation ponctuelle pour le diagnostic d’amylose héréditaire transthyrétine, Ala97Ser, la mutation la plus courante endémique à Taïwan, en prenant comme exemple.
Les tests génétiques sont le test plus fiable pour la transthyrétine héréditaire associés amylose et doit être effectué dans la plupart des cas d’amylose transthyrétine (ATTR). ATTR est une maladie rare mais fatale avec des phénotypes hétérogènes ; par conséquent, le diagnostic est parfois retardé. Avec l’attention et la reconnaissance plus large sur les manifestations précoces d’ATTR ainsi que de nouveaux traitements, études diagnostiques appropriées, y compris la transthyrétine (TTR) génétique tester, pour confirmer les types et variantes de ATTR sont donc fondamentaux pour améliorer le pronostic. Des analyses génétiques avec des méthodes polymerase chain reaction (PCR) confirment la présence de mutations ponctuelles TTR beaucoup plus rapidement et plus sûr que les méthodes conventionnelles telles que la tache méridionale. Ici, nous démontrons confirmation génétique de la mutation Ala97Ser ATTR, la mutation la plus courante endémique à Taïwan. Le protocole comprend quatre grandes étapes : collecte des échantillons de sang total, extraction de l’ADN, l’analyse génétique de tous les quatre exons TTR avec PCR et séquençage de l’ADN.
Amylose (ATTR) de la transthyrétine (TTR) est la forme la plus courante d’amylose systémique héréditaire1et peut être causée par une mutation autosomique dominante héritée dans le gène de la transthyrétine (TTR)2. Les mutations de TTR déstabilisent la structure de la protéine tétramère et conduisent à sa dissociation en monomères qui réassemble en fibrilles amyloïdes2. Plus de 100 mutations de TTR amyloïdogène ont été signalés dans le monde1. Les analyses génétiques avec des méthodes polymerase chain reaction (PCR) confirment la présence de mutation ponctuelle TTR et ont des avantages, notamment en évitant la manipulation de la sonde radioactivement marqués par rapport à la tache méridionale3. PCR est une technique rapide, facile, bon marchée et fiable qui a été appliquée à nombreux domaines dans les sciences modernes,4.
Le diagnostic précoce de cette maladie progressive et mortelle est un défi compte tenu de son hétérogénéité phénotypique. Avec l’attention et la reconnaissance plus large sur les manifestations précoces de ATTR ainsi que les nouveaux traitements5, études diagnostiques appropriées y compris test génétique TTR sont donc critique fondamentales pour améliorer le pronostic. En outre, différentes mutations sont associées à différente pénétrance de ce trait, l’âge d’apparition, modes de progression, gravité de la maladie, la survie médiane, l’efficacité de la transplantation hépatique, ou TTR stabilisateurs2,6, et degrés variables de participation neurologique et cardiologique, ayant des répercussions sur grandes conseil génétique7,8,9. En outre, un test génétique très précis est le seul outil qui différencie les deux types distincts de ATTR : héréditaire (mutant) et type sauvage (forme non-mutant, amylose systémique sénile, SSA)7. Il est impératif de confirmer les types d’ATTR, parce que les traitements varient largement2. Il y a donc une nécessité croissante pour décrire le protocole par étapes des tests génétiques TTR.
L’approche moléculaire pour détecter la mutation sera illustrée à l’aide de Ala97Ser, la mutation la plus courante endémique à Taïwan, à titre d’exemple. Modifications dans l’étape d’extraction de l’ADN réduire le montant des trois solutions utilisées et donne une quantité suffisante d’ADN. Dans ce protocole, tous les quatre exons TTR ont été analysés, tandis que les régions y compris les 5′ en amont, 3′ en aval, promoteurs, introns, et régions non traduites (UTR) n’étaient pas séquencées.
Il y a deux étapes cruciales au sein du protocole. Tout d’abord, afin d’avoir un nombre suffisant de globules blancs, un spécimen de hémodilué devrait être évité11. Deuxièmement, l’utilisation des amorces PCR appropriées est fondamentale pour obtenir des résultats fiables,12. Nous avons utilisé l’outil web de Primer-BLAST pour concevoir les amorces4,13; un minimum de 40 paires de bases sur chaque …
The authors have nothing to disclose.
Nous tenons à remercier Miss Fun-Shin Wu pour son aide dans les expériences. Cette étude a été financée par une subvention du programme de recherche médicale Chang Gung (CMRPG3C0371, CMRPG3C0372, CMRPG3C0373) et IRB 100-4470A3, 104-2462A3, Taiwan.
EDTA-treated tubes | BD | ||
DNA Extraction Kit | Stratagen | 200600 | |
NanoDrop ND2000 spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | NanoDrop 2000 | |
Delicate Task Wipers | Kimberly-Clark | Kimtech Science Kimwipes | |
AmpliTaq Gold 360 DNA Polymerase kit | Applied Biosystems | 4398823 | |
TTR gene intronic primers | Exon1 | F: 5’-TCAGATTGGCAGGGATAAGC-3’ | |
Exon1 | R: 5’-GCAAAGCTGGAAGGAGTCAC-3’ | ||
Exon2 | F: 5’-TCTTGTTTCGCTCCAGATTTC-3’ | ||
Exon2 | R: 5’-TCTACCAAGTGAGGGGCAAA-3’ | ||
Exon3 | F: 5’-GTGTTAGTTGGTGGGGGTGT-3’ | ||
Exon3 | R: 5’-TGAGTAAAACTGTGCATTTCCTG-3’ | ||
Exon4 | F: 5’-GACTTCCGGTGGTCAGTCAT-3’ | ||
Exon4 | R: 5’-GCGTTCTGCCCAGATACTTT-3’ | ||
thermocycler | Applied Biosystems | GeneAmp PCR System 9700 | |
electrophoresis cell | ADVANCE | Mupid-2plus | |
DNA ladder | Protech | PT-M1-100 | |
dye | BioLabs | B7021 | |
AlphaImager EC | Alpha Innotech | AlphaImager EC | |
automatic sequencer | Applied Biosystems | 3730xl DNA Analyzer |