ניתוח גנטי של Transthyretin Ala97Ser תורשתיות הקשורות עמילואידוזיס
Summary
כאן, אנו מציגים פרוטוקול כדי לאשר הנוכחות של נקודת מוטציה לאבחון של עמילואידוזיס transthyretin תורשתי, Ala97Ser, המוטציה אנדמיים הנפוץ ביותר בטייוואן, כדוגמא.
Abstract
בדיקה גנטית היא הבדיקה האמינה ביותר עבור transthyretin תורשתי הקשורים עמילואידוזיס צריכה להתבצע ברוב המקרים של transthyretin עמילואידוזיס (הפו). הפו היא מחלה נדירה אך קטלנית עם פנוטיפים הטרוגניות; לכן, האבחנה לפעמים מתעכב. עם הגדלת תשומת לב והכרה רחבה יותר על הגילויים המוקדמים של הפו, כמו גם טיפולי המתעוררים, מחקרים האבחון המתאים, כולל את transthyretin (TTR) גנטי לבדוק, כדי לאשר את סוגי, ולכן הם וריאציות של הפו היסוד כדי לשפר את הפרוגנוזה. ניתוח גנטי עם שיטות (PCR) תגובת שרשרת של פולימראז ולאשש את קיומן של מוטציות נקודה TTR הרבה יותר מהר ובטוח יותר מאשר בשיטות המקובלות כגון תספיג דנ א. במסמך זה, נדגים אישור גנטי של המוטציה Ala97Ser הפו, המוטציה אנדמיים הנפוץ ביותר בטייוואן. הפרוטוקול כוללת ארבעה שלבים עיקריים: איסוף דגימות דם, הפקת דנ א, ניתוח גנטי של כל ארבע TTR exons עם PCR, ואת רצפי DNA.
Introduction
Transthyretin (TTR) עמילואידוזיס (הפו) היא הצורה הנפוצה ביותר של עמילואידוזיס מערכתית תורשתי1, עלולה להיגרם כתוצאה מוטציה דומיננטית תורשתית אוטוזומלית ג’ין transthyretin (TTR)2. מוטציות TTR יציבות מבנה החלבון tetrameric, להוביל דיסוציאציה שלה לתוך מונומרים זה ומרכיב לתוך הסיבים עמילואיד2. יותר מ-100 מוטציות TTR amyloidogenic כבר דווח על ברחבי העולם1. ניתוח גנטי עם שיטות (PCR) תגובת שרשרת של פולימראז לאשר הנוכחות של מוטציה נקודת TTR ויש יתרונות כולל הימנעות הטיפול radioactively שכותרתו הגששים בהשוואה תספיג דנ א3. PCR הוא מהיר, קל, זול ואמין טכניקה שהוחלו לשדות רבים מדעי מודרני4.
אבחון מוקדם של המחלה מתקדמת, חמורה הוא מאתגר בהתחשב הטרוגניות פנוטיפי שלה. עם הגדלת תשומת לב והכרה רחבה יותר על הביטויים המוקדמים של הפו, כמו גם טיפולים המתעוררים5, מחקרים האבחון המתאים, כולל בדיקות גנטיות TTR ולכן הם אנושות הבסיסית כדי לשפר את הפרוגנוזה. יתר על כן, מוטציות שונות קשורים עם penetrance שונים של התכונה, הגיל של תחילת, דפוסים של התקדמות, חומרת המחלה, חציון ההישרדות, היעילות של השתלת כבד, או מייצבים TTR2,6, ו מעלות משתנה במעורבות נוירולוגית, תרופות, אשר יש השלכות נהדר על יעוץ גנטי-7,–8,–9. חוץ מזה, בדיקה גנטית ומדויקים הוא הכלי היחיד אשר מבדיל בין שני סוגי הפו ברורים: תורשתי (מוטציה) וסוג הפרוע (טופס שאינו-מוטציה, עמילואידוזיס מערכתית סנילי, הסוכן המיוחד)7. זה הכרחי כדי לאשר את סוגי הפו, כי הטיפולים קיימים הבדלים2. לכן, אין הצורך הגובר לתאר את הפרוטוקול stepwise של הבדיקה הגנטית TTR.
הגישה מולקולרית כדי לזהות את המוטציה יומחשו באמצעות Ala97Ser, המוטציה אנדמיים הנפוץ ביותר בטייוואן, כדוגמה. שינויים בשלב הפקת דנ א להפחית את כמות הפתרונות שלושה בשימוש ותשואות כמות מספקת של ה-DNA. פרוטוקול זה, כל ארבע TTR exons נותחו, בעוד אזורים כולל 5′ במעלה הזרם, 3′ במורד הזרם, היזמים, אינטרונים, אזורים לא מתורגם (UTR) היו לא רציף.
Protocol
Representative Results
Discussion
ישנם שני שלבים קריטיים בתוך הפרוטוקול. ראשית, על מנת לקבל מספר מספיק של כדוריות הדם הלבנות, הדגימה hemodiluted צריך להיות נמנעה11. שנית, השימוש תחל PCR המתאים הוא היסוד כדי להשיג תוצאות אמינות12. השתמשנו בכלי האינטרנט פריימר-הפיצוץ כדי לעצב את4,תחל<sup class="…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מאחלים תודה גברת שין-כיף וו לה עזרה בניסויים. מחקר זה נתמך על ידי מענק של תכנית המחקר הרפואי של צ’נג קונג (CMRPG3C0371, CMRPG3C0372, CMRPG3C0373) ו IRB 100-4470A3, 104-2462A3, טייוואן.
Materials
| EDTA-treated tubes | BD | ||
| DNA Extraction Kit | Stratagen | 200600 | |
| NanoDrop ND2000 spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | NanoDrop 2000 | |
| Delicate Task Wipers | Kimberly-Clark | Kimtech Science Kimwipes | |
| AmpliTaq Gold 360 DNA Polymerase kit | Applied Biosystems | 4398823 | |
| TTR gene intronic primers | Exon1 | F: 5’-TCAGATTGGCAGGGATAAGC-3’ | |
| Exon1 | R: 5’-GCAAAGCTGGAAGGAGTCAC-3’ | ||
| Exon2 | F: 5’-TCTTGTTTCGCTCCAGATTTC-3’ | ||
| Exon2 | R: 5’-TCTACCAAGTGAGGGGCAAA-3’ | ||
| Exon3 | F: 5’-GTGTTAGTTGGTGGGGGTGT-3’ | ||
| Exon3 | R: 5’-TGAGTAAAACTGTGCATTTCCTG-3’ | ||
| Exon4 | F: 5’-GACTTCCGGTGGTCAGTCAT-3’ | ||
| Exon4 | R: 5’-GCGTTCTGCCCAGATACTTT-3’ | ||
| thermocycler | Applied Biosystems | GeneAmp PCR System 9700 | |
| electrophoresis cell | ADVANCE | Mupid-2plus | |
| DNA ladder | Protech | PT-M1-100 | |
| dye | BioLabs | B7021 | |
| AlphaImager EC | Alpha Innotech | AlphaImager EC | |
| automatic sequencer | Applied Biosystems | 3730xl DNA Analyzer |
Referências
- Planté-Bordeneuve, V., Said, G. Familial amyloid polyneuropathy. The Lancet Neurology. 10 (12), 1086-1097 (2011).
- Planté-Bordeneuve, V., et al. Long-term treatment of transthyretin familial amyloid polyneuropathy with tafamidis: a clinical and neurophysiological study. Journal of Neurology. 264 (2), 268-276 (2017).
- Nichols, W. C., Benson, M. D. Hereditary amyloidosis: detection of variant prealbumin genes by restriction enzyme analysis of amplified genomic DNA sequences. Clinical Genetics. 37 (1), 44-53 (1990).
- Lorenz, T. C. Polymerase Chain Reaction: Basic Protocol Plus Troubleshooting and Optimization Strategies. Journal of Visualized Experiments. (63), e3998 (2012).
- Hsu, H. C., et al. Phenotypic expressions of hereditary Transthyretin Ala97Ser related Amyloidosis (ATTR) in Taiwanese. BMC Neurology. 17 (1), 178 (2017).
- Barroso, F. A., et al. Long-term safety and efficacy of tafamidis for the treatment of hereditary transthyretin amyloid polyneuropathy: results up to 6 years. Amyloid. 24 (3), 194-204 (2017).
- Rapezzi, C., et al. Disease profile and differential diagnosis of hereditary transthyretin-related amyloidosis with exclusively cardiac phenotype: an Italian perspective. European Heart Journal. 34 (7), 520-528 (2013).
- Mariani, L. L., et al. Genotype-phenotype correlation and course of transthyretin familial amyloid polyneuropathies in France. Annals of Neurology. 78 (6), 901-916 (2015).
- Hammarström, P., Jiang, X., Hurshman, A. R., Powers, E. T., Kelly, J. W. Sequence-dependent denaturation energetics: A major determinant in amyloid disease diversity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99, 16427-16432 (2002).
- Johnson, M., Zaretskaya, I., Raytselis, Y., Merezhuk, Y., McGinnis, S., Madden, T. L. NCBI BLAST: a better web interface. Nucleic Acids Research. 36, 5-9 (2008).
- Fox, A. J., et al. Next generation sequencing for the detection of actionable mutations in solid and liquid tumors. Journal of Visualized Experiments. (115), (2016).
- Date, Y., Nakazato, M., Kangawa, K., Shirieda, K., Fujimoto, T., Matsukura, S. Detection of three transthyretin gene mutations in familial amyloidotic polyneuropathy by analysis of DNA extracted from formalin-fixed and paraffin-embedded tissues. Journal of the Neurological Sciences. 150 (2), 143-148 (1997).
- Ye, J., Coulouris, G., Zaretskaya, I., Cutcutache, I., Rozen, S., Madden, T. L. Primer-BLAST: a tool to design target-specific primers for polymerase chain reaction. BMC Bioinformatics. 13, 134 (2012).
- Green, M. R., Sambrook, J. . Molecular cloning: A laboratory manual. , (2012).
- Buckingham, L., Flaws, M. L. . Molecular diagnostics: Fundamentals, methods, and clinical applications. , (2012).
- Tan, S. C., Yiap, B. C. DNA, RNA, and Protein Extraction: The Past and The Present. Journal of Biomedicine and Biotechnology. 2009, (2009).
- Rapezzi, C., et al. Systemic cardiac amyloidoses: disease profiles and clinical courses of the 3 main types. Circulation. 120 (13), 1203-1212 (2009).
- Gertz, M. A., Dispenzieri, A., Sher, T. Pathophysiology and treatment of cardiac amyloidosis. Nature Reviews Cardiology. 12 (2), 91-102 (2015).
- Vrana, J. A., et al. Clinical diagnosis and typing of systemic amyloidosis in subcutaneous fat aspirates by mass spectrometry-based proteomics. Haematologica. 99 (7), 1239-1247 (2014).
- Nakamura, M., et al. Identification of a new transthyretin variant (Ile49) in familial amyloidotic polyneuropathy using electrospray ionization mass spectrometry and nonisotopic RNase cleavage assay. Human Heredity. 49 (4), 186-189 (1999).
- Ueda, M., Ando, Y. Recent advances in transthyretin amyloidosis therapy. Translational Neurodegeneration. 3, 19 (2014).
- Brown, E. E., et al. Genetic testing improves identification of transthyretin amyloid (ATTR) subtype in cardiac amyloidosis. Amyloid. 24 (2), 92-95 (2017).
- Tasaki, M., et al. Rapid detection of wild-type and mutated transthyretins. Annals of Clinical Biochemistry. 53 (4), 508-510 (2015).
- Plante-Bordeneuve, V., et al. Diagnostic pitfalls in sporadic transthyretin familial amyloid polyneuropathy (TTR-FAP). Neurology. 69 (7), 693-698 (2007).
- Hsu, J. L., et al. A prospective, observational study of patients with uncommon distal symmetric painful small-fiber neuropathy. PLoS ONE. 12 (9), 0183948 (2017).
- Salvi, F., Pastorelli, F., Plasmati, R., Bartolomei, I., Dall’Osso, D., Rapezzi, C. Genotypic and phenotypic correlation in an Italian population of hereditary amyloidosis TTR-related (HA-TTR): Clinical and neurophysiological aids to diagnosis and some reflections on misdiagnosis. Amyloid. 19, 58-60 (2012).
- Suhr, O. B., Lundgren, E., Westermark, P. One mutation, two distinct disease variants: Unravelling the impact of transthyretin amyloid fibril composition. Journal of Internal Medicine. 281 (4), 337-347 (2017).
- Vilà-Rico, M., et al. Quantitative analysis of post-translational modifications in human serum transthyretin associated with familial amyloidotic polyneuropathy by targeted LC-MS and intact protein MS. Journal of Proteomics. 127, 234-246 (2015).
