आनुवंशिक विश्लेषण वंशानुगत Transthyretin Ala97Ser सम्बन्धित Amyloidosis
Summary
यहां, हम एक प्रोटोकॉल वर्तमान वंशानुगत transthyretin amyloidosis के निदान के लिए बिंदु उत्परिवर्तन की उपस्थिति की पुष्टि, Ala97Ser, ताइवान में सबसे आम स्थानिकमारी वाले उत्परिवर्तन का उपयोग कर, एक उदाहरण के रूप में ।
Abstract
आनुवंशिक परीक्षण वंशानुगत transthyretin संबंधित amyloidosis के लिए सबसे विश्वसनीय परीक्षण है और transthyretin amyloidosis (ATTR) के अधिकांश मामलों में किया जाना चाहिए । ATTR विषम phenotypes के साथ एक दुर्लभ लेकिन घातक रोग है; इसलिए निदान कभी-कभार देरी होती है । ATTR के प्रारंभिक अभिव्यक्तियों के साथ-साथ उभरते उपचारों, उपयुक्त नैदानिक अध्ययनों, जिनमें transthyretin (TTR) आनुवंशिक परीक्षण शामिल हैं, के प्रकार और ATTR के वेरिएंट की पुष्टि करने के लिए अधिक ध्यान और व्यापक मांयता के साथ इसलिए मौलिक पूर्वानुमान में सुधार करने के लिए । पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (पीसीआर) तरीकों के साथ आनुवंशिक विश्लेषण TTR बिंदु उत्परिवर्तनों की उपस्थिति की पुष्टि बहुत अधिक जल्दी और दक्षिणी दाग जैसे पारंपरिक तरीकों से सुरक्षित । इस के साथ साथ, हम ATTR Ala97Ser उत्परिवर्तन, ताइवान में सबसे आम स्थानिक उत्परिवर्तन के आनुवंशिक पुष्टि प्रदर्शित करता है । प्रोटोकॉल चार मुख्य कदम शामिल हैं: पूरे रक्त नमूना इकट्ठा, डीएनए निष्कर्षण, पीसीआर के साथ सभी चार TTR exons के आनुवंशिक विश्लेषण, और डीएनए अनुक्रमण.
Introduction
Transthyretin (TTR) amyloidosis (ATTR) वंशानुगत प्रणालीगत amyloidosis1का सबसे आम रूप है, और एक autosomal की वजह से हो सकता है मुख्य रूप से Transthyretin (TTR) जीन2में उत्परिवर्तन विरासत में मिला । TTR उत्परिवर्तनों tetrameric प्रोटीन संरचना को अस्थिर और मोनोमर कि amyloid तंतुओं2में reइक्ट्ठा में अपनी पृथक्करण के लिए सीसा । से अधिक १०० amyloidogenic TTR उत्परिवर्तनों1दुनिया भर में सूचित किया गया है । पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (पीसीआर) तरीकों के साथ आनुवंशिक विश्लेषण TTR बिंदु उत्परिवर्तन की उपस्थिति की पुष्टि और दक्षिणी ब्लाट3के साथ तुलना में रेडियोधर्मी लेबल जांच की हैंडलिंग से बचने सहित लाभ है । पीसीआर एक तेज, आसान, सस्ता और विश्वसनीय तकनीक है कि आधुनिक विज्ञान4में कई क्षेत्रों के लिए लागू किया गया है ।
इस प्रगतिशील और घातक रोग का शीघ्र निदान अपनी phenotypic विविधता को देखते हुए चुनौतीपूर्ण है. बढ़ती ध्यान और ATTR के प्रारंभिक अभिव्यक्तियों पर व्यापक मांयता के साथ ही साथ उभरते उपचार5, TTR आनुवंशिक परीक्षण सहित उचित नैदानिक अध्ययन इसलिए गंभीर रूप से पूर्वानुमान में सुधार मौलिक हैं । इसके अलावा, विभिन्न उत्परिवर्तनों विशेषता के विभिन्न penetrance के साथ जुड़े रहे हैं, शुरुआत की उम्र, प्रगति के पैटर्न, रोग गंभीरता, औसत अस्तित्व, जिगर प्रत्यारोपण की प्रभावकारिता, या TTR स्थिरता2,6, और स्नायविक और cardiological शामिल है, जो आनुवंशिक परामर्श7,8,9के लिए महान निहितार्थ है की चर डिग्री । वंशानुगत (उत्परिवर्ती) और जंगली प्रकार (गैर उत्परिवर्ती फार्म, बूढ़ा प्रणालीगत amyloidosis, एसएसए)-इसके अलावा, एक बहुत ही सटीक आनुवंशिक परीक्षण ATTR के दो अलग प्रकार के अंतर है कि केवल उपकरण है7। यह ATTR के प्रकार की पुष्टि करने के लिए आवश्यक है, क्योंकि चिकित्सा व्यापक रूप से बदलती हैं2. इसलिए, वहां एक बढ़ती आवश्यकता को TTR आनुवंशिक परीक्षण के stepwise प्रोटोकॉल का वर्णन है ।
आणविक दृष्टिकोण उत्परिवर्तन का पता लगाने के लिए Ala97Ser, ताइवान में सबसे आम स्थानिकमारी वाले उत्परिवर्तन का उपयोग कर सचित्र होगा, एक उदाहरण के रूप में । डीएनए निष्कर्षण कदम में संशोधन तीन समाधान इस्तेमाल की राशि को कम करने और डीएनए की एक पर्याप्त मात्रा में पैदावार । इस प्रोटोकॉल में, सभी चार TTR exons विश्लेषण किया गया था, जबकि 5 ‘ नदी के ऊपर, 3 ‘ बहाव, प्रवर्तकों, introns, और unमराठीमध्ये क्षेत्रों (UTR) सहित क्षेत्रों अनुक्रम नहीं थे ।
Protocol
Representative Results
Discussion
प्रोटोकॉल के भीतर दो महत्वपूर्ण चरण हैं । सबसे पहले, आदेश में सफेद रक्त कोशिकाओं की पर्याप्त संख्या है, एक hemodiluted नमूना11से बचा जाना चाहिए । दूसरा, उपयुक्त पीसीआर प्राइमरों का उपयोग विश्वसनीय<sup class…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम उसके प्रयोगों में मदद के लिए मिस शिन-फन वू शुक्रिया अदा करना चाहते हैं । इस अध्ययन में चांग गुंग मेडिकल रिसर्च प्रोग्राम (CMRPG3C0371, CMRPG3C0372, CMRPG3C0373) और आईआरबी 100-4470A3, 104-2462A3, ताइवान से अनुदान का समर्थन किया गया था ।
Materials
| EDTA-treated tubes | BD | ||
| DNA Extraction Kit | Stratagen | 200600 | |
| NanoDrop ND2000 spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | NanoDrop 2000 | |
| Delicate Task Wipers | Kimberly-Clark | Kimtech Science Kimwipes | |
| AmpliTaq Gold 360 DNA Polymerase kit | Applied Biosystems | 4398823 | |
| TTR gene intronic primers | Exon1 | F: 5’-TCAGATTGGCAGGGATAAGC-3’ | |
| Exon1 | R: 5’-GCAAAGCTGGAAGGAGTCAC-3’ | ||
| Exon2 | F: 5’-TCTTGTTTCGCTCCAGATTTC-3’ | ||
| Exon2 | R: 5’-TCTACCAAGTGAGGGGCAAA-3’ | ||
| Exon3 | F: 5’-GTGTTAGTTGGTGGGGGTGT-3’ | ||
| Exon3 | R: 5’-TGAGTAAAACTGTGCATTTCCTG-3’ | ||
| Exon4 | F: 5’-GACTTCCGGTGGTCAGTCAT-3’ | ||
| Exon4 | R: 5’-GCGTTCTGCCCAGATACTTT-3’ | ||
| thermocycler | Applied Biosystems | GeneAmp PCR System 9700 | |
| electrophoresis cell | ADVANCE | Mupid-2plus | |
| DNA ladder | Protech | PT-M1-100 | |
| dye | BioLabs | B7021 | |
| AlphaImager EC | Alpha Innotech | AlphaImager EC | |
| automatic sequencer | Applied Biosystems | 3730xl DNA Analyzer |
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