Genetisk analyse av arvelige Transthyretin Ala97Ser relaterte amyloidose
Summary
Her presenterer vi en protokoll for å bekrefte tilstedeværelse av punkt mutasjon for diagnostisering av arvelige transthyretin amyloidose, med Ala97Ser, den vanligste endemisk mutasjonen i Taiwan, som eksempel.
Abstract
Genetisk testing er den mest pålitelige testen for arvelig transthyretin relatert amyloidose og skal utføres i de fleste tilfeller av transthyretin amyloidose (ATTR). ATTR er en sjelden, men dødelig sykdom med heterogene fenotyper; diagnosen er derfor noen ganger utsettes. Med økende oppmerksomhet og bredere anerkjennelse på tidlig manifestasjoner av ATTR samt nye behandlinger, passende diagnostiske undersøkelser, inkludert transthyretin (TTR) genetisk test for å bekrefte hvilke og varianter av ATTR er derfor grunnleggende å forbedre prognosen. Genetiske analyser polymerase kjedereaksjon (PCR) metoder bekrefte tilstedeværelse av TTR punkt mutasjoner mye raskere og sikrere enn konvensjonelle metoder som sørlige blot. Her viser vi genetisk bekreftelse av ATTR Ala97Ser mutasjon, vanligste endemisk mutasjon i Taiwan. Protokollen består av fire hovedtrinn: samle helblodprøve, DNA utvinning, genetisk analyse av alle fire TTR exons med PCR, og DNA sekvensering.
Introduction
Transthyretin (TTR) amyloidose (ATTR) er den vanligste formen for arvelig systemisk amyloidose1, og kan skyldes et autosomalt nesten kun arvet mutasjon i transthyretin (TTR) gen2. TTR mutasjoner destabilisere tetramerisk protein strukturen og føre til sin avstandtagen til monomerer som setter sammen igjen i amyloid fibrils2. Mer enn 100 amyloidogenic TTR mutasjoner har vært rapportert over hele verden1. Genetiske analyser polymerase kjedereaksjon (PCR) metoder bekrefte tilstedeværelse av TTR punkt mutasjon og har fordeler inkludert unngå håndtering av radioactively merket sonder med sørlige blot3. PCR er en rask, enkel, billig og pålitelig teknikk som brukes på mange felt i moderne vitenskap4.
Tidlig diagnostikk av denne progressive og fatal sykdommen er utfordrende gitt sin fenotypiske heterogenitet. Med økende oppmerksomhet og bredere anerkjennelse på tidlig manifestasjoner av ATTR samt nye behandlinger5, er passende diagnostiske undersøkelser inkludert TTR genetisk test derfor kritisk grunnleggende forbedre prognose. Videre ulike mutasjoner er knyttet til ulike penetrance av trekk, alder for debut, mønstre av progresjon, sykdommens alvorlighetsgrad, median overlevelse, effekten av leveren transplantasjon eller TTR stabilisatorer2,6, og variabel grader nevrologiske og cardiological engasjement, som har store konsekvenser for genetisk rådgiving7,8,9. Dessuten en svært nøyaktig genetisk test er det eneste verktøyet som skiller de to forskjellige typene ATTR: arvelig (mutant) og vill-type (ikke-mutant skjemaet, senile systemisk amyloidose, SSA)7. Det er viktig å bekrefte hvilke typer ATTR, fordi behandling varierer2. Derfor er det en økende nødvendighet å beskrive gradvis protokollen av TTR genetisk test.
Molekylær tilnærmingen å oppdage mutasjon vil bli belyst med Ala97Ser, den vanligste endemisk mutasjonen i Taiwan, som eksempel. Endringer i DNA utvinning trinn redusere tre løsninger brukes og gir en tilstrekkelig mengde DNA. I denne protokollen, alle fire TTR exons ble analysert, mens regioner, inkludert 5′ oppstrøms, 3′ nedstrøms, arrangører, introns, og uoversatt regioner (UTR) var ikke sekvensielt.
Protocol
Representative Results
Discussion
Det er to avgjørende skritt i protokollen. Først for å få tilstrekkelig antall hvite blodlegemer, bør en hemodiluted prøven være unngått11. Andre er bruk av riktig PCR primer grunnleggende for å få pålitelige resultater12. Vi brukte Primer-BLAST web verktøyet for å designe primere4,13; minimum 40 base parene på hver side av de fire TTR-exons bør dekkes. Vi har også kjøre BLAST på NCBI å sjekke spe…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi ønsker å takke Miss Shin-moro Wu for henne hjelp i forsøkene. Denne studien ble støttet av et stipend fra Chang Gung Medical Research Program (CMRPG3C0371, CMRPG3C0372, CMRPG3C0373) og IRB 100-4470A3, 104-2462A3, Taiwan.
Materials
| EDTA-treated tubes | BD | ||
| DNA Extraction Kit | Stratagen | 200600 | |
| NanoDrop ND2000 spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | NanoDrop 2000 | |
| Delicate Task Wipers | Kimberly-Clark | Kimtech Science Kimwipes | |
| AmpliTaq Gold 360 DNA Polymerase kit | Applied Biosystems | 4398823 | |
| TTR gene intronic primers | Exon1 | F: 5’-TCAGATTGGCAGGGATAAGC-3’ | |
| Exon1 | R: 5’-GCAAAGCTGGAAGGAGTCAC-3’ | ||
| Exon2 | F: 5’-TCTTGTTTCGCTCCAGATTTC-3’ | ||
| Exon2 | R: 5’-TCTACCAAGTGAGGGGCAAA-3’ | ||
| Exon3 | F: 5’-GTGTTAGTTGGTGGGGGTGT-3’ | ||
| Exon3 | R: 5’-TGAGTAAAACTGTGCATTTCCTG-3’ | ||
| Exon4 | F: 5’-GACTTCCGGTGGTCAGTCAT-3’ | ||
| Exon4 | R: 5’-GCGTTCTGCCCAGATACTTT-3’ | ||
| thermocycler | Applied Biosystems | GeneAmp PCR System 9700 | |
| electrophoresis cell | ADVANCE | Mupid-2plus | |
| DNA ladder | Protech | PT-M1-100 | |
| dye | BioLabs | B7021 | |
| AlphaImager EC | Alpha Innotech | AlphaImager EC | |
| automatic sequencer | Applied Biosystems | 3730xl DNA Analyzer |
Referências
- Planté-Bordeneuve, V., Said, G. Familial amyloid polyneuropathy. The Lancet Neurology. 10 (12), 1086-1097 (2011).
- Planté-Bordeneuve, V., et al. Long-term treatment of transthyretin familial amyloid polyneuropathy with tafamidis: a clinical and neurophysiological study. Journal of Neurology. 264 (2), 268-276 (2017).
- Nichols, W. C., Benson, M. D. Hereditary amyloidosis: detection of variant prealbumin genes by restriction enzyme analysis of amplified genomic DNA sequences. Clinical Genetics. 37 (1), 44-53 (1990).
- Lorenz, T. C. Polymerase Chain Reaction: Basic Protocol Plus Troubleshooting and Optimization Strategies. Journal of Visualized Experiments. (63), e3998 (2012).
- Hsu, H. C., et al. Phenotypic expressions of hereditary Transthyretin Ala97Ser related Amyloidosis (ATTR) in Taiwanese. BMC Neurology. 17 (1), 178 (2017).
- Barroso, F. A., et al. Long-term safety and efficacy of tafamidis for the treatment of hereditary transthyretin amyloid polyneuropathy: results up to 6 years. Amyloid. 24 (3), 194-204 (2017).
- Rapezzi, C., et al. Disease profile and differential diagnosis of hereditary transthyretin-related amyloidosis with exclusively cardiac phenotype: an Italian perspective. European Heart Journal. 34 (7), 520-528 (2013).
- Mariani, L. L., et al. Genotype-phenotype correlation and course of transthyretin familial amyloid polyneuropathies in France. Annals of Neurology. 78 (6), 901-916 (2015).
- Hammarström, P., Jiang, X., Hurshman, A. R., Powers, E. T., Kelly, J. W. Sequence-dependent denaturation energetics: A major determinant in amyloid disease diversity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99, 16427-16432 (2002).
- Johnson, M., Zaretskaya, I., Raytselis, Y., Merezhuk, Y., McGinnis, S., Madden, T. L. NCBI BLAST: a better web interface. Nucleic Acids Research. 36, 5-9 (2008).
- Fox, A. J., et al. Next generation sequencing for the detection of actionable mutations in solid and liquid tumors. Journal of Visualized Experiments. (115), (2016).
- Date, Y., Nakazato, M., Kangawa, K., Shirieda, K., Fujimoto, T., Matsukura, S. Detection of three transthyretin gene mutations in familial amyloidotic polyneuropathy by analysis of DNA extracted from formalin-fixed and paraffin-embedded tissues. Journal of the Neurological Sciences. 150 (2), 143-148 (1997).
- Ye, J., Coulouris, G., Zaretskaya, I., Cutcutache, I., Rozen, S., Madden, T. L. Primer-BLAST: a tool to design target-specific primers for polymerase chain reaction. BMC Bioinformatics. 13, 134 (2012).
- Green, M. R., Sambrook, J. . Molecular cloning: A laboratory manual. , (2012).
- Buckingham, L., Flaws, M. L. . Molecular diagnostics: Fundamentals, methods, and clinical applications. , (2012).
- Tan, S. C., Yiap, B. C. DNA, RNA, and Protein Extraction: The Past and The Present. Journal of Biomedicine and Biotechnology. 2009, (2009).
- Rapezzi, C., et al. Systemic cardiac amyloidoses: disease profiles and clinical courses of the 3 main types. Circulation. 120 (13), 1203-1212 (2009).
- Gertz, M. A., Dispenzieri, A., Sher, T. Pathophysiology and treatment of cardiac amyloidosis. Nature Reviews Cardiology. 12 (2), 91-102 (2015).
- Vrana, J. A., et al. Clinical diagnosis and typing of systemic amyloidosis in subcutaneous fat aspirates by mass spectrometry-based proteomics. Haematologica. 99 (7), 1239-1247 (2014).
- Nakamura, M., et al. Identification of a new transthyretin variant (Ile49) in familial amyloidotic polyneuropathy using electrospray ionization mass spectrometry and nonisotopic RNase cleavage assay. Human Heredity. 49 (4), 186-189 (1999).
- Ueda, M., Ando, Y. Recent advances in transthyretin amyloidosis therapy. Translational Neurodegeneration. 3, 19 (2014).
- Brown, E. E., et al. Genetic testing improves identification of transthyretin amyloid (ATTR) subtype in cardiac amyloidosis. Amyloid. 24 (2), 92-95 (2017).
- Tasaki, M., et al. Rapid detection of wild-type and mutated transthyretins. Annals of Clinical Biochemistry. 53 (4), 508-510 (2015).
- Plante-Bordeneuve, V., et al. Diagnostic pitfalls in sporadic transthyretin familial amyloid polyneuropathy (TTR-FAP). Neurology. 69 (7), 693-698 (2007).
- Hsu, J. L., et al. A prospective, observational study of patients with uncommon distal symmetric painful small-fiber neuropathy. PLoS ONE. 12 (9), 0183948 (2017).
- Salvi, F., Pastorelli, F., Plasmati, R., Bartolomei, I., Dall’Osso, D., Rapezzi, C. Genotypic and phenotypic correlation in an Italian population of hereditary amyloidosis TTR-related (HA-TTR): Clinical and neurophysiological aids to diagnosis and some reflections on misdiagnosis. Amyloid. 19, 58-60 (2012).
- Suhr, O. B., Lundgren, E., Westermark, P. One mutation, two distinct disease variants: Unravelling the impact of transthyretin amyloid fibril composition. Journal of Internal Medicine. 281 (4), 337-347 (2017).
- Vilà-Rico, M., et al. Quantitative analysis of post-translational modifications in human serum transthyretin associated with familial amyloidotic polyneuropathy by targeted LC-MS and intact protein MS. Journal of Proteomics. 127, 234-246 (2015).
